Контрольная работа
по биологии
2009
Содержание
1. Методы определения аффинности антител
Определение аффинности антител в сыворотке или выделенных в очищенном виде представляет собой сложную экспериментальную и теоретическую задачу. Трудности обусловлены следующими обстоятельствами.
Во-первых, гетерогенностью антител по физико-химическим свойствам, в том числе по сродству к антигену. Во-вторых, сложностью определения общего количества антител, а также отдельных фракций. В-третьих, в случае поливалентных антигенов возможностью образования комплексов сложного состава, в том числе циклической структуры, в которых проявляется кооперативность взаимодействия активных центров антител. Все это не позволяет применить традиционные методы для расчета истинных значений констант связывания. Более надежные данные могут быть получены для моноклональных антител и их Fab-фрагментов, так как в этом случае могут быть выделены индивидуальные антитела в гомогенном виде.
Истинные значения констант связывания важны для определения термодинамических характеристик процесса взаимодействия · антиген -- антитело. Для практических целей, в частности для разработки методов иммуноферментного анализа, достаточно знать эффективные значения, характеризующие свойства используемых антител.
Рассмотрим принципиальные подходы к определению констант равновесия. Из уравнения следует, что для расчетов необходимо знать концентрации свободного и связанного с антителами антигена в условиях равновесия. Обычно для этого используют антигены, меченные маркером, который с высокой чувствительностью может быть определен одним из доступных физико-химических методов.
Все методы, позволяющие определять концентрации свободного и связанного антигена, можно условно разбить на две большие группы. К первой относятся методы, в которых стадия разделения свободного и связанного антигена осуществляется путем избирательного осаждения, аффинного связывания или гельфильтрации. Если реагенты достаточно сильно различаются своими молекулярными массами и размерами, то процедура разделения существенно упрощается. В случае корпускулярных антигенов оставшиеся несвязанные антитела могут быть отделены либо центрифугированием, либо пропусканием смеси через фильтр, задерживающий антиген. Для низкомолекулярных антигенов используется равновесный диализ.
Вторая группа включает методы, базирующиеся на изменении физико-химических свойств антигенов при комплексообразовании с антителами: тушении или усилении флуоресценции, изменении степени поляризации флуоресценции, ингибировании ферментативной активности.
Равновесный диализ -- наиболее распространенный метод изучения реакции антиген -- антитело. Метод основан на различной способности антител и гаптена проходить через полупроницаемые мембраны. Раствор каждого реагента известной концентрации в одном и том же растворителе с одинаковой ионной силой и значением рН помещают по разные стороны мембраны. Молекулы гаптена диффундируют в раствор антител и связываются с ними. При достижении равновесия концентрация свободного гаптена выравнивается по обе стороны мембраны. Измерив равновесную концентрацию гаптена, можно рассчитать количество гаптена, связанного с антителами, и определить по уравнению константу связывания.
Как правило, метод равновесного диализа применяется для низкомолекулярных соединений с Afr<3000. Это обстоятельство существенно ограничивает область использования метода. К недостаткам метода надо также отнести относительно большое время достижения равновесия и необходимость учета эффектов, вызываемых присутствием мембраны, в результате чего необходимо работать с достаточно высокими концентрациями реагентов, что значительно понижает чувствительность определения константы связывания.
Методы фракционного осаждения используются для разделения комплексов антиген -- антитело и несвязавшегося антигена. Они основаны на способности высокомолекулярных комплексов антиген--антитело избирательно осаждаться различными реагентами. При установлении в системе равновесия осаждающий реагент добавляют в такой концентрации^ при которой комплекс антиген--антитело и несвязавшиеся антитела становятся нерастворимыми и выпадают в осадок, который легко может быть удален центрифугированием.
Методы, не включающие фазовое разделение вступившего и не вступившего в реакцию антигена, относятся к группе гомогенных методов.
Флуоресцентные методы основаны на способности остатков триптофана в молекулах белков флуоресцировать при возбуждении УФ светом. Взаимодействие ряда антигенов с антителами приводит к изменению интенсивности флуоресценции, что может быть использовано для оценки количества антигена, вступившего в реакцию с антителами. В зависимости от химической структуры антигена может наблюдаться как усиление, так и гашение флуоресценции. Степень гашения интенсивности свечения зависит от концентрации активных центров антител, константы их ассоциации с антигеном и пропорциональна концентрации образовавшихся специфических комплексов. Методы флуоресценции просты, не занимают много времени и имеют высокую чувствительность, что сокращает расход реагентов.
Таблица 1. Методы определения аффинности антител
Методы
Используемые антигены
Равновесный диализ Осаждение глобулиновой фракции сульфатом аммония
Осаждение углем, модифицированным декстраном
Осаждение антиглобулинами
Гельфильтрация, разделение по молекулярной массе
Тушение флуоресценции
Усиление флуоресценции Поляризация флуоресценции Спектральные методы Тушение биолюминесценции
Гаптены, диализуемые антигены Гаптены, антигены, растворимые
при 50%-ном насыщении сульфатом
аммония Гаптены
Гаптеиы, белки, полисахариды Гаптены, белковые полисахариды
Гаптены и антигены со специфическими флуоресцентными свойствами Гаптеиы, белки Гаптены, белки
Гаптены, связанные с красителем Гаптены, белки
Метод деполяризации флуоресценции основан на измерении поляризации флуоресценции антигена, меченного красителем, до взаимодействия с антителами и после комплексообразования. Поляризация флуоресценции определяется молекулярным объемом частицы и степенью ее асимметрии. Комплексообразование антигена с антителом сопровождается резким изменением поляризации флуоресценции красителя, который играт роль метки антигена или антитела. Предел обнаружения антигена этими методами достаточно мал. Недостатками методов, основанных на измерении флуоресценции, являются необходимость работы с препаратами очищенных антител и строгие требования к структуре изучаемых антигенов. Вследствие этого флуоресцентные методы не являются универсальными и могут быть применены для ограниченной группы антигенов.
Методы тушения биолюминесценции основаны на использовании в качестве маркера АТР, пришитой к' молекуле антигена. В составе такого комплекса молекула АТР сохраняет активность в реакции биолюминесценции, катализируемой светлячковой люциферазой. При добавлении антител образуется комплекс с антигеном, в котором молекула АТР становится недоступной ферменту, в результате чего ингибируется реакция биолюминесценции. Указанный метод обладает высокой чувствительностью, что позволяет измерять константы ассоциации до 10-12 М.
Перечень экспериментальных методов определения аффинности взаимодействия антиген -- антитело приведен в табл. 1.
2. Способы расчета констант комплексообразования реакции антиген -- антитело
Взаимодействие одной субпопуляции антител с моновалентным антигеном. Этот наиболее простой случай реализуется, например, при связывании гаптена с Fab-фрагмента-ми моноклональных антител и описывается простейшей схемой.
Из системы уравнений материального баланса
с учетом для константы равновесия комплексообразования можно легко получить выражения равновесной концентраций образовавшегося комплекса
1. Один из часто используемых способов расчета константы состоит в исследовании зависимости образующегося комплекса от общей концентрации антигена о. Если при достаточно больших концентрациях антигена в системе выполняется условие, то принимает вид
Эта зависимость является аналогом изотермы адсорбции Лэнгмюра в теории адсорбции или уравнения Михаэлиса-Ментеи в ферментативной кинетике. Из выражения следует, что при предельных значениях концентрации 0 концентрация комплекса стремится к общей концентрации центров связывания 0. Для вычисления К определяют концентрацию антигена 'о, при которой половина антител находится в виде комплекса с антигеном. С учетом выражений и можно получить
Из выражения следует, что '0 = 1/К при условии 1/К">о. При обратном соотношении данный метод определения К неприемлем.
Зависимость концентрации образующегося комплекса от общей концентрации антигена в растворе
Графическое определение константы связывания в двойных обратных координатах
2. Иногда для вычисления константы связывания К используют представление экспериментальных данных зависимости концентрации комплекса от концентрации свободного антигена в системе двойных обратных координат:
При постоянной концентрации антител в системе варьируют начальную концентрацию антигена и в условиях равновесия определяют концентрацию свободного и связанного в комплекс антигена. График в двойных обратных координатах представляет собой прямую линию с тангенсом угла наклона, отсекающую на оси ординат отрезок
В условиях избытка антигена анализ проводят в координатах 1/0.
3. Наиболее часто для анализа комплексообразования используют метод Скэтчарда, основанный на исследовании зависимости отношения равновесной концентрации комплекса к концентрации свободного антигена от концентрации комплекса.
Аналитический вид уравнения Скэтчарда легко получить из выражения для константы комплексообразования и уравнения материального баланса:
В литературе часто эти координаты обозначают в символах.B/F-i-B. Зависимость Скэтчарда имеет вид прямой с тангенсом угла наклона -- К, отсекающей на оси ординат отрезок К о, а на оси абсцисс 0. Графическая обработка экспериментальных данных в координатах Скэтчарда позволяет вычислить не только равновесную константу связывания, но и концентрацию активных центров антител 0 в системе.
На практике при нахождении константы данным способом проводят серию опытов по определению равновесной концентрации свободного антигена при различных начальных концентрациях антигена и постоянной концентрации антител в системе.
4. В качестве еще одного преобразования уравнений и используют следующее:
Разделив числитель и знаменатель части равенства на концентрацию антител 0 и логарифмируя выражение, получаем
В координатах, называемых координатами Хилла, должна получаться прямая с тангенсом угла наклона, равным единице, пересекающая ось ординат в точке IgK.
Страницы: 1, 2
