Для определения активности ФМСФ-ингибируемой КП 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl, или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мМ ингибитора ФМСФ, приготовленного на этаноле, который добавляли после смешивания гомогената ткани с буфером (в случае контрольной пробы). Пробы преинкубировали 8 мин при 37?С, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37?С 210 мкМ раствора дансил-фен-лей-арг, приготовленного на воде. Далее пробы обрабатывали как описано для КПH. Активность фермента определяли как разницу в приросте флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ФМСФ и выражали в нмоль дансил-фен-лей, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Концентрацию белка оп-ределяли методом Лоури [80].
2.2.2 Метод определения каталазы
В две колбы наливали по 7 мл дистиллированной воды и добавляли в них по 1 мл гомогената. Содержимое кипятили 2 - 3 мин. В обе вносили по 2 мл 1% H2O2 и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Затем приливали по 5 мл 10% H2SO4 и оттитровывали содержимое 0,05н KMnO4 до розового цвета.
Расчет: 1мл 0,05 н KMnO4 -- 0,85 г H2O2. Таким образом, разницу в результатах титрования контроля и опыта умножаем на эту величину, получали количество мг перекиси.
2.2.3 Метод определения активности церулоплазмина
Активность церулоплазмина определяли модифицированным методом Ревина, который базируется на окислении p-фенилендиамина при участии этого фермента. Ферментативную реакцию останавливают добавлением фтористого натрия. По оптической плотности образующихся продуктов судят о концентрации церулоплазмина.
В обычные химические пробирки вносили по 0,1 мл гомогената. В одну из пробирок, служащую контрольной, добавляли 2 мл раствора фтористого натрия (с целью инактивации ферментативной активности церулоплазмина). Затем во все пробирки помещали по 8 мл ацетатного буфера и по 1 мл раствора p-фенилендиамина (используемого в качестве субстрата). Пробирки встряхивали и ставили на 1ч в водяную баню с температурой +37?С. После инкубации во все пробирки, за исключением контрольной, доливали по 2 мл раствора фтористого натрия. Содержимое пробирок перемешивали и переносили в холодильник, где выдерживали в течение 30 мин при +4?С. Пробы колориметрировали на ФЭКе с зеленым светофильтром (530нм) в кюветах с шириной слоя 10 мм. Результаты сравнивали с данными контрольной пробы (бледно-розовая окраска). Умножали значения оптической плотности на коэффициент пересчета 875, получали величину концентрации церулоплазмина в мг/л.
2.2.4. Метод определения уровня продуктов перекисного окисления липидов (диеновых и триеновых конъюгатов)
Для экстракции липидов брали 1 мл 25% гомогената плацентарной ткани, приливали 3 мл метанола, перемешивали стеклянной палочкой, встряхивали в течение 15 мин, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. Добавляли 3 мл гексана, вновь тщательно перемешивали стеклянной палочкой, встряхивали в течение 15 мин и оставляли отстаиваться на 30 мин. После разделения слоев, верхний (метанол-гексановый слой) отбирали в сухую пробирку и использовали для исследований.
Уровень диеновых конъюгатов определяли спектрофотометрически при длине волны 233 нм, кетодиенов и сопряженных триенов - при длине волны 278 нм, ненасыщенных липидов - при длине волны 220 нм. Рассчитывали содержание диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов по отношению к уровню ненасыщенных липидов (E233/E220 и E278/E220).
2.2.5 Метод определения уровня гидроперекисей
Для приготовления гомогената использовали буфер 0,025 М трис HCl (pH 7,4), содержащий 0,175 М хлорида калия. Гомогенат (25%) по 2 мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок добавлением 0,2 мл 50%-ного раствора ТХУ.
Образующийся осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин. при 4000g. 2 лм надосадочной жидкости доводят 96% этанолом до 27 мл. К равным объемам до 27 мл добавляют 0,2 мл концентрированной соляной кислоты и 0,025 мл 5%-ного раствора соли Мора в 3%-ной соляной кислоте, пробы интенсивно встряхивают. Точно через 30с приливают 1мл 20%-ного раствора роданистого калия, после чего развивается малиновая окраска. В качестве контроля используют пробы, содержащие 96%-ный этанол вместо НЖ. Изменение оптической плотности проводят в течение 10 мин. после добавления роданистого калия при 480 нм.
2.2.6 Статистическая обработка результатов исследования
Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента. Корреляционный анализ проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Активность КПН и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в плацентарной ткани в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести
Результаты исследования показали достоверное снижение активности КПH и ФМСФ-КП в плацентарной ткани при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в 2 раза по сравнению с нормой (рисунок 1, 2).
Рисунок 1. Активность карбоксипептидазы H в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести (нмоль продукта, образовавшегося за 1мин инкубации на 1мг белка; M±m; *** - p<0,001 относительно нормы)
По данным корреляционного анализа выявлена положительная взаимосвязь между активностью КПН и ФМСФ-КП в плацентарной ткани. Уменьшение активности КПH согласуется с данными литературы о снижении концентрации белковых гормонов в фетоплацентарном комплексе (ФПК) при ОПГ-гестозах [7,8,9,11,12,13]. Наиболее важными из них являются хорионический гонадотропин, плацентарный лактоген, пролактин, инсулин, инсулиноподобные факторы роста, C - пептид и др.
Рисунок 2. Активность ФМСФ-КП в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести (нмоль продукта, образовавшегося за 1мин инкубации на 1мг белка; M±m; *** - p<0,001 относительно нормы)
По данным корреляционного анализа выявлена положительная взаимосвязь между активностью КПН и ФМСФ-КП в плацентарной ткани. Учитывая, что КПH ассоциирована с процессингом пептидных гормонов [5,16], можно предположить участие фермента в образовании выше указанных биологически активных веществ.
Гестоз является стрессом для ФПК. В условиях патологии отмечено повышение уровней кортикотропин-рилизинг-фактор (КТРФ) и опиоидов в плацентарной ткани [5,8,9,10]. КТРФ, в свою очередь, снижает уровень хорионического гонадотропина, что ведет к угнетению синтеза прогестерона и эстрогенов, которые обладают антиоксидантной активностью. Это усугубляет негативное действие ПО липидов и белков на клеточные мембраны, что может приводить к снижению активности КПH и ФМСФ-КП.
Обнаруженная положительная корреляция между активностью КПН и ФМСФ-КП (r (коэффициент корреляции)=0,9255***) позволяет предположить участие ФМСФ-КП в процессинге регуляторных пептидов в плацентарной ткани.
Таким образом, КПH и ФМСФ-КП плаценты играют важную роль в патогенезе ОПГ-гестоза. Возможно, полученные результаты могут быть основой для дальнейшего исследования гомеостаза ФПК и изыскания способов коррекции метаболических изменений в плаценте при патологическом течении беременности.
3.2 Исследование активности антиоксидантной системы и показателей перекисного окисления липидов в плацентарной ткани в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести
Результаты исследования показали достоверное снижение активности каталазы и церулоплазмина в плацентарной ткани при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в 1,2 раза по сравнению с нормой (рисунок 3).
Рисунок 3. Активность каталазы в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в плацентарной ткани (** - p<0,01 относительно нормы).
Рисунок 4. Активность церулоплазмина в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в плацентарной ткани (* - p<0,05 относительно нормы).
Снижение активности этих ферментов можно объяснить начавшимся угнетением антиоксидантной системы фетоплацентарного комплекса в условиях осложненной беременности.
По данным корреляционного анализа обнаружена положительная взаимосвязь активности церулоплазмина с активностью КПH в плацентарной ткани (r=0,4749*).
Результаты исследования показали достоверное повышение уровня гидроперекисей липидов, а также достоверное снижение концентрации диеновых и триеновых коньюгатов в плацентарной ткани при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести.
Рисунок 5. Концентрация гидроперекисей в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в плацентарной ткани (*-p<0,05 относительно нормы).
Рисунок 6. Активность диеновых коньюгатов в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в плацентарной ткани (*-p<0,05 относительно нормы).
Рисунок 7. Активность триеновых коньюгатов в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в плацентарной ткани (*-p<0,01 относительно нормы).
По данным корреляционного анализа обнаружены взаимосвязи уровня триеновых коньюгатов с активностью КПН (r=0,6**) и ФМСФ-КП (r=0,5778 **). В патогенезе ОПГ-гестозов ведущую роль играет нарушение структурно-функциональных свойств клеточных мембран плаценты. В условиях патологии усиливается перекисное окисление липидов (ПОЛ) и белков на фоне снижения активности антиоксидантной системы, что является причиной повреждения мембран [6,7,8,9,10,11,12,13].
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ОПГ - гестоз (отек, протеинурия, гипертензия) - это осложнение беременности, обусловленное несоответствием возможностей адаптивных систем организма матери и потребностей развивающегося плода.
Несмотря на многочисленные исследования, проблема гестозов (преэклампсия, гипертония, индуцированная беременностью) остается актуальной. Частота их составляет 8-16%. Они занимают 2-3 место в структуре материнской смертности, являясь одновременно основной причиной неблагоприятных перинатальных исходов. При этом материнская смертность достигает 3,5%, а перинатальная -- 79% [2,6,7].
До настоящего времени причина гестозов достоверно не установлена. Среди причин поздних гестозов, особенно тяжелых форм, ведущее место принадлежит экстрагенитальной патологии, аутоиммунным нарушениям, эндокринным заболеваниям, психологической дезадаптации женщины и другим. Высокая частота гестоза, тяжесть его клинических проявлений, большая вероятность неблагоприятного исхода беременности при этом осложнении для матери и плода обусловливают повышенный интерес к исследованию патогенетических механизмов данной патологии.
ОПГ-гестозы вызывают нарушения компенсаторно-приспособительных механизмов ФПК на молекулярном, клеточном, тканевом, органном, организменном уровнях [67радз], что реализуется в компенсированной, субкомпенсированной и декомпенсированной формах плацентарной недостаточности (ПН). При этом наблюдается комплекс нарушений транспортной, трофической, эндокринной и метаболической функции плаценты, лежащих в основе патологии плода (нередким клиническим проявлением ПН является задержка внутриутробного развития плода, его гипоксия и гипотрофия) и новорожденного (нарушения мозгового кровообращения, кривошея, снижение мышечного тонуса и угнетение физиологических рефлексов).
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
