Таким образом, механизмы нейропротекции при гибернации связаны с гипотермией, лейкоцитопенией, снижением синтеза белка, повышением антиоксидантного статуса клеток мозга и , по-видимому, могут включать в себя также и изменение пролиферации клеток мозга ни только в направлении образования новых нейронов, как показано на моделях ишемического повреждения мозга, но и в пролиферации эндотелиальных клеток сосудов мозга и клеток глии [ 24 ].

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Объект исследования

В работе использовали отделы мозга взрослых сусликов Citellus undulatus обоего пола массой 280-400 г, отловленных в Якутии.

2.2 Условия гибернации

Животных содержали в индивидуальных ячейках, снабжённых термодатчиком, в условиях естественного освещения при свободном доступе к воде и пище. В середине октября сусликов переносили в специальное помещение, где они впадали в спячку при температуре воздуха 4°С и находились там до полного пробуждения (середина апреля). Опыты проведены на 7 группах сусликов, взятых в разные фазы гибернационного цикла и на разных стадиях снижения и повышения температуры тела:

1 группа (n=8) - бодрствующие активные в летний период (июнь) животные, контроль;

2 группа (n=7) - животные, входящие в спячку осенью при температуре тела +36 ?С ;

3 группа (n=7) - животные, входящие в спячку осенью при температуре тела +10 ?С ;

4 группа (n=10) - спящие животные (январь),середина баута;

5 группа (n=4) - спонтанно пробудившиеся животные, межбаутное бодрствование;

6 группа (n=10) - животные, пробудившиеся весной при температуре тела +25 ?С;

7 группа (n=5) - животные, пробудившиеся весной при температуре тела +10 ?С.

Моделирование состояния зимней спячки у сусликов осуществляли сотрудники института Биофизики клетки РАН (Пущино-на-Оке).

2.3 Подготовка образцов тканей мозга для анализа

Мозг сусликов вынимали, охлаждали в ледяном изотоническом растворе NaСl и на льду выделяли кору больших полушарий, мозжечок, гиппокамп, гипоталамус и ствол мозга. Образцы замораживались и хранились в жидком азоте, а затем были любезно предоставлены нам для анализа ведущим научным сотрудником института Биофизики клетки РАН (Пущино-на-Оке) д.б.н. Семеновой Т.П.

Ткани гомогенизировали при 4°С в гомогенизаторе Поттера (1500 об/мин) в течение 15-20 сек в 5 объемах буфера (HEPES 20мМ рН 7,4). Затем гомогенаты центрифугировали 30 мин при 13000 g и 4°С. Полученный супернатант аликвотировали, замораживали и использовали в дальнейших исследованиях.

2.4 Биохимические методы исследования

2.4.1 Определение содержания белка

Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд [ 16 ]. К 10 мкл супернатанта в оптимальном разведении добавляли 500 мкл 0.01% раствора красителя Кумасси ярко синего G-250 и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. После этого измеряли поглощение при 595 нм. В качестве калибровочного стандарта использовали бычий сывороточный альбумин в диапазоне концентраций 0,1-0,8 мг/мл. В этом диапазоне концентраций стандартного белка поглощение при 595 нм линейно зависит от концентрации белка и поэтому все пробы, после предварительного эксперимента, разводили до получения оптической плотности, соответствующей линейному участку у стандарта.

2.4.2 Электрофорез в полиакриламидном геле. Вестерн-блот

Электрофорез в ПАГГ применяется для разделения белков по молекулярной массе под действием электрического тока. В качестве стандартного образца используют белки-маркеры с молекулярными массами 11-170 кДа.

Для разделения исследуемых белков использовался 10% разделяющий (нижний) гель (2,5 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,875 мл 4хTris/Cl/SDS pH=8,8; 3,125 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) и 3,9% концентрирующий (верхний) гель (0,65 мл 30% АА, 0,8% bisАА; 1,25 мл 4хTris/Cl/SDS pH=6,8; 3,05 мл Н2О; 25 мкл 10% аммония персульфата; 5 мкл TEMED) .

Подготовка проб к электрофорезу осуществлялась следующим образом: к аликвоте супернатанта объёмом 100 мкл добавляли 20 мкл Sample buffer, кипятили 5 мин при 100°С и охлаждали до комнатной температуры. Затем пробы центрифугировали 5 мин при 13000 g и комнатной температуре и отбирали супернатант, который перед нанесением на гель разводили таким образом, чтобы конечная концентрация белка в нём составляла 60 мкг на лунку геля.

Электрофоретическое разделение исследуемых белков проводилось в денатурирующих условиях (использовался 1х Running buffer, содержащий 1% додецилсульфата натрия (Tris, глицин, SDS)) 1-1,5ч при 200 V. Перенос белков с геля на мембрану PVDF осуществлялся в Transfer buffer (Tris, глицин,этиловый спирт) 45-60 мин при 150 mА,110 V.

2.4.3 Выявление белков клеточного цикла и циклинзависимой киназы Cdk5

Мембрану с перенесенными белками блокировали в течение 15 - 16 ч для предотвращения неспецифического связывания в 5% растворе обезжиренного молока в TBST (50 мМ Tris/Cl , pH=7,5; 0,9% NaCl; 0,05% Tween 20), после чего инкубировали с различными разведениями специфических первичных антител в 5% молоке в TBST 2ч при комнатной температуре или 15-16ч при 40С. Для удаления несвязавшихся антител мембрану отмывали 4-х кратно в TBST в течение 30 мин. Связавшиеся первичные антитела выявляли с помощью вторичных антител, полученных у другого вида животных против первичных, конъюгированных с пероксидазой хрена. Связывание антител визуализировали на рентгеновской пленке с использованием хемилюминесцентной системы, которая в присутствии пероксидазы хрена окисляется с выделением квантов света.

Детекцию белков проводили в оптимальных условиях, которые были подобраны ранее.

Таблица 1

Условия иммунодетекции исследуемых белков при Вестерн-блот анализе.

2.5 Статистическая обработка результатов

Статистический анализ осуществлялся с помощью программы Statistica 7 с использованием t-критерия Стьюдента.

Различие считалось достоверным при уровне значимости Р<0,05.

Все исследования выполнены в лаборатории функциональной биохимии нервной системы института Высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

Автор выражает глубокую благодарность за оказанную всестороннюю помощь при выполнении работы сотрудникам лаборатории функциональной биохимии нервной системы института Высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, отдельно к.б.н. Онуфриеву Н.В. и д.б.н., профессору Гуляевой Н.В.

Глава 3. Полученные результаты и их обсуждение

Экспрессия белков клеточного цикла и Cdk 5 имеет различный уровень в исследованных отделах мозга и зависит от функционального состояния сусликов.

Гибернация достоверно снижает в гиппокампе уровень экспрессии Cdc 2, Cdk 2 и Cdk 4, а экспрессия MCM 2 и Cdk 5 имеет лишь тенденции к снижению по сравнению с контролем (активные животные) (рис.2) . Экспрессия циклинов. А и В1 остаётся практически на том же уровне, что и у активных сусликов. У спонтанно пробудившихся животных уровень экспрессии исследуемых белков также существенно не изменялся по сравнению с контролем. Однако на стадии пробуждения при температуре + 25°С была выявлена положительная корреляция между циклином В1 и МСМ 2 (r = 0,97 ,p < 0,05). Возможно, на стадии пробуждения при температуре + 25°С образование МСМ 2 идет однонаправленно с биосинтезом Сn B1 в отличие от пробуждения при температуре + 10°С (известно, что комплекс МСМ 2/МСМ4 является субстратом для комплекса Cdc2/Cn B1 in vitro). МСМ 2 является маркёром репликации ДНК, его уровень возрастает при переходе клетки из фазы G1 в S фазу клеточного цикла. А циклин В1 активируется в конце фазы G2, образуя комплекс с Cdc 2, небходимый для начала последней стадии цикла - М фазы (собственно митоза).

Рис. 2 Экспрессия исследуемых белков в гиппокампе сусликов CITELLUS UNDULATUS на разных стадиях гибернационного цикла

Страницы: 1, 2, 3