На рис. 10.17 представлена более сложная суммарная схема биосинтеза фосфолипидов в эукариотических клетках. Синтез жирных кислот происходит как в эндоплазматическом ретикулуме, так и в митохондриях. В качестве субстрата используется ацил-СоА, поскольку животные клетки не содержат эквивалента белку -- переносчику ацила. Большинство ферментов, участвующих в биосинтезе фосфолипидов, локализовано на цитоплазматической стороне мембраны эндоплазматического ретикулума, но есть и исключения. В эукариотических клетках, как и в Е. coli, синтез фосфатидилглицерола и кардиолипина может осуществляться через промежуточное образование CDP-диацилглицерола. Однако ферменты, необходимые для этого, содержатся во внутренней мембране митохондрий, и эти фосфолипиды обнаруживаются только в митохондриях. Низшие эукариоты тоже могут синтезировать фосфати-дилсерин с помощью механизма, используемого Е. coli, но соответствующий фермент обнаружен как в эндоплазматическом ретикулуме, так и в митохондриях. В дрожжах на долю фосфатидил-серина приходится только около 5% всех фосфолипидов, но он является предшественником фосфатидилэтаноламина и фосфатиднл-холина.

Эукариоты, в том числе и дрожжи, могут синтезировать фосфа-тидилэтаноламин и фосфатидилхолин в ходе реакции с участием 1,2-днацилглицерола. Это основной путь синтеза фос-фолипидов в животных клетках. Затем специальные ферменты, находящиеся в эидоплазматическом ретикулуме высших эука-риот, катализируют реакцию обмена полярных головок, в результате чего образуется фосфат идил серии. Эта реакция необходима высшим эукариотам для получения фосфатидилсерииа. После образования в эидоплазматическом ретикулуме фосфат идил-серии декарбоксилируется до фосфатидил этанол амина. Фермент, катализирующий эту реакцию, фосфат идил сериндека рбоксил аз а, находится в митохондриях. Следовательно, фосфатидилсерин может быть главным предшественником фосфатидилэтаноламина в клетке. Для осуществления этой последовательности реакций должен происходить перенос липидов между эндоплазматическим ретикулумом и митохондрией. Фосфатидилэтаноламин может превращаться в фосфати-дилхолин с помощью одной или двух метилаз, содержащихся в эндоплазматическом ретикулуме, но этот путь обычно не является главным.

Двумя липидными компонентами, которые локализуются в основном в плазматической мембране, являются сфингомиелин и холестерол. По-видимому, сфингомиелин образуется в некоторых клетках путем переноса фосфатидилхолиновой группы от фосфати-дилхолина на церамид с помощью какого-то фермента, присутствующего в плазматической мембране. Напротив, несмотря на то, что холестерол концентрируется в основном в плазматической мембране, он синтезируется при участии ферментов, содержащихся в гладком эндоплазматическом ретикулуме и, возможно, в пероксисо-мах.

11. ТРАНСПОРТ ЛИПИДОВ ОТ МЕСТА ИХ СИНТЕЗА

Перенос мембранных липидов от места их синтеза к месту назначения осуществляется при помощи двух процессов: 1) трансмембранного флип-флоп-перехода; 2) внутримембранного транспорта. Скорость флип-флоп-перехода фосфолипидов особенно велика для тех мембран, в которых происходит биосинтез липидов; ее характерное время составляет величину порядка нескольких минут. Имеются данные о том, что этот процесс осуществляется при участии белков и, возможно, требует гидролиза АТР. Было также показано, что холестерол способен к быстрому спонтанному флип-флоп-переходу. Следовательно, транспорт через мембрану эндоплазматического ретикулума из цитозоля в просвет происходит довольно быстро.

В транспорте липидов от одной клеточной мембраны к другой участвуют несколько процессов. В разных случаях наиболее важным может оказаться какой-то один из них.

Самопроизвольный перенос липидов путем диффузии мономерных липидных единиц через водную фазу.

Диффузия липидов через постоянные или временные места соединения двух контактирующих мембран.

Транспорт с участием белков, катализируемый или белками, облегчающими высвобождение липидов из донорной мембраны, или липидсвязывающими белками.

Транспорт с участием везикул, при котором липиды, как и мембранные белки, транспортируются в ходе непрерывного отпо-

чковывания и слияния с мембранами внутриклеточных везикул. Этот процесс может быть энергозавнсимым.

Рассмотрим вначале, что известно о самопроизвольной диффузии мембранных липидов между мембранами. Как показывают многочисленные исследования, липиды могут самопроизвольно перемещаться между моноламелляриыми везикулами или между фосфолипидными везикулами и биомембранамн. В большинстве случаев при этом происходит десорбция мономериых липидов с поверхности донорной мембраны и свободная диффузия через водную среду к акцепторной мембране. Лимитирующим этапом является высвобождение липидов из донорной мембраны. В этих условиях характерное время переноса зависит от величины свободной энергии десорбции. Ясно, что менее водорастворимые липиды должны преодолевать при десорбции более высокий энергетический барьер, а следовательно, их перенос должен осуществляться медленнее. Скорость переноса зависит не только от гидрофобности переносимого липнда, но и от состава и физического состояния донорного бислоя. Например, ганглиозид GMb находясь в фосфатидилхолиновых везикулах, существует в монодисперсном состоянии. Благодаря наличию гидрофильных полярных групп он не совершает флип-флоп-переходов через мембрану везикул, но характерное время его переноса везикулами составляет около 40 ч при 45 °С. Напротив, нейтральные ганглиозиды, лишенные остатков сиаловой кислоты, образуют в везикулах гелеобразный кластер, и характерное время их переноса составляет около 500 ч. Смесь холестеро-ла и фосфолипидов в везикулах тоже образует сложные фазы, и это может влиять на кинетику переноса холестерола. Стабилизация холестерола в мембране могла бы происходить за счет благоприятных взаимодействий со специфическими фосфо-липидами, например со сфингомиелином.

В табл. 10.2 приведены характерные времена переноса некоторых мембранных липидов. На одном конце шкалы находятся эфи-ры холестерола, которые являются в высшей степени неполярными и не переносятся между мембранами с помощью диффузии мономеров. На другом конце -- лизофосфолипиды, очень быстро мигрирующие между мембранами. Обычно характерное время переноса холестерола составляет 1 -- 2 ч. Таким образом, возникает вопрос, как поддерживается уникальное распределение липидов в различных мембранах.

Перенос новосинтезированного холестерола из эндоплазматиче-ского ретикулума в плазматическую мембрану осуществляется всего за 10 мин. На процесс оказывают влияние агенты, блокирующие биоэнергетические реакции в клетке, например цианид. Эти и другие данные свидетельствуют о том, что внутриклеточный транспорт холестерола является энерогозависимым процессом и протекает при участии везикул. В принципе он может перевесить любой спонтанный перенос. Однако единого мнения на этот счет не выработано. Серьезной проблемой является то, что оценки доли холестерола, присутствующего в плазматической мембране, от общего его количества в клетке сильно варьируют. На первый взгляд кажется, что количество холестерола, поступающего в некоторые клетки и выходящего из них, можно оценить, используя данные о скорости самопроизвольной диффузии мономеров, однако неясно, пригодны ли в данном случае механизм спонтанного переноса и указанные скорости.

Характерное время переноса фосфолипидов из фосфолипидных везикул гораздо больше, чем холестерола. Например, для дипальмитоилфосфатидилхолина оно составляет 83 ч при 37° в случае везикул из димиристоилфосфатидилхолина. Скорость переноса фосфолипидов с помощью этого механизма слишком мала, чтобы соответствовать реальным скоростям межмембранного транспорта.

Прокариоты

Остановимся вначале на переносе фосфолипидов в случае грам-отрицательных бактерий. Это относительно простая система, поскольку в ней имеются только две мембраны. Фосфолипиды синтезируются в плазматической мембране и должны транспортироваться в наружную мембрану. Имеются данные о том, что между этими мембранами осуществляется быстрый обмен ли-п идами. Так, фосфатидил этанол амин достигает наружной мембраны за характерное время ~ 3 мин. В этом процессе не участвуют белки, липиды или АТР, ио ои каким-то образом зависит от протондвижущей силы. Липиды, внедрившиеся в наружную мембрану, могут также быстро перемещаться к внутренней мембране; это относится даже к фосфатидилхолину, который в норме не обнаруживается в Е. coli. Таким образом, процесс, по-видимому, не является специфическим. Тем не менее у мутантиого штамма с дефектной диацилглнцеролкиназой диацилглицерол накапливается в плазматической мембране и к наружной мембране не транспортируется.

Механизм липидиого обмена между этими двумя мембранами неизвестен, но обычно полагают, что внутренняя и наружная мембраны имеют места соединения или области адгезии. По-видимому, именно через эти участки и происходит диффузия липидов. Здесь же могут концентрироваться белки, экспортируемые к наружной мембране.

Эукариоты

Механизм распределения фосфолипидов в эукариотических клетках гораздо более сложен. Единственным фосфолипидом, который локализуется исключительно в месте своего синтеза, в митохондрии, является кардиолипин. Как показывают многочисленные эксперименты, внутриклеточный транспорт фосфолипидов осуществляется значительно быстрее, чем если бы он определялся самопроизвольной диффузией в водной среде. Например, перенос новосинтезированного фосфолипида от эндоплазматического рети-кулума к митохондриям в клетках печени крысы происходит всего за несколько минут. Поскольку декарбоксилаза, катализирующая превращение фосфатидилсерина в фосфатидилэтаноламин, содержится в митохондриях, данные о скорости этой реакции могут использоваться для контроля за переносом фосфатидилсерина из эндоплазматического ретикулума в митохондрию. Показано, что скорость переноса весьма высока и процесс ингибируется азидом и агентами, блокирующими биоэнергетические реакции. Обнаружено также, что новосинтезированный фосфолипид в течение нескольких минут транспортируется к плазматической мембране, хотя скорость переноса очень сильно зависит от самого липида и типа клетки. В некоторых случаях транспорт липидов блокируется ингибиторами биоэнергетических реакций и/или агентами, разрушающими цитоскелет. Общепринято, что скорость переноса липидов выше скорости диффузии.

Одним из способов, позволяющих облегчить перенос фосфолипидов между мембранами, является участие в этом процессе белков. Выделен целый ряд водорастворимых белков, участвующих в межмембранном переносе фосфолипидов in vitro. Все они имеют липидсвязывающие участки и образуют водорастворимые комплексы с фосфолипидами. Эти белки облегчают обмен липидов «один к одному» между мембранами путем переноса мономеров. В одних случаях связывание липндов происходит с высокой специфичностью и сродством, в других сродство и специфичность относительно низки. В принципе при низком сродстве способность белка катализировать перенос липидов от одной мембраны к другой должна повышаться, поскольку белок при этом может возвращаться к донорной мембране, имея незанятый липидсвязывающнй участок. Белки, переносящие фосфолипиды, были выделены не только из животных клеток, но и из бактерий и клеток растений. Очищены белки, связывающиеся с гликолипидами и длинноцепочечными жирными кислотами,

К сожалению, функция белков, переносящих фосфолипиды, до сих пор не продемонстрирована in vivo, поэтому неясно, играют ли они физиологическую роль во внутриклеточном переносе фосфолипидов. Не исключено, что этот перенос опосредуется везикулами, а возможно, функционируют оба механизма.

Важно понять, что так или иначе распределение фосфолипидов среди различных клеточных мембран детерминируется белками. Если распределение липидов равновесно, то оно определяется сродством белков, присутствующих в разных мембранах, к липидам. Смещение в распределении некоторых липидов из-за взаимодействия их с белками может влиять на распределение других липидов, например холестерола. Если распределение липидов неравновесно, то липидный состав разных мембран будет определяться скоростью транспортировки липидов к мембранам и от них, но и в этом случае кинетика процесса будет зависеть от участия в нем определенных белков.

12. ОБНОВЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ

Данные о скорости обновления липидов весьма скудны, известно лишь, что она весьма велика. В животных клетках половина всех фосфолипидов обновляется на протяжении одного или двух клеточных делений. Скорость обновления полярной и неполярной частей фосфолипидной молекулы неодинакова. По-видимому, это связано с действием внелизосомных фосфолипаз и ацилтрансфераз, которые вызывают перестройку внутриклеточных фосфолипидов in situ. Сфинголипиды расщепляются в лизосомах, и когда процесс их деградации нарушается, возникает патологическое состояние. Например, при болезни Ниманна--Пика происходит накопление сфинго-миелина из-за недостатка лизосомного фермента сфннгомиелиназы. Деградация гликосфинголипндов in vivo также происходит в лизосомах, как полагают, с участием белков, которые специфически связываются с определенными липидами и, вероятно, растворяют их.

У Е. coli имеются по крайней мере 10 деградирующих ферментов, которые могут участвовать в процессе обновления фосфолипидов, однако об их функциях in vivo известно немного. При экспоненциальном росте скорость обновления глицерольного остова и жирнокислотных цепей мала; по-видимому, невелика и скорость обмена ацильных групп. Однако обновление глицеро-фосфатной головки фосфатидилглицерола происходит необычайно быстро. Это связано с использованием фосфатидилглицерола в качестве донора 5л-глицерол-1-фосфата для синтеза олигосахаридов мембранного происхождения. Эти олигосахариды содержатся в периплазматическом пространстве и играют роль в осмотической адаптации организма. В ходе реакции происходит превращение фос-фатидилглицерола в диацилглицерол, который затем превращается с помощью диацилглнцеролкиназы в фосфатидную кислоту.

13. Изменения липидного состава мембран в ответ на изменения условий окружающей среды

Из всего сказанного ясно, что о механизме контроля липидного состава клеточных мембран известно очень мало. Одно из минимальных требований состоит в том, что мембранные липиды должны образовывать стабильный бислой, находящийся в жидкокристаллическом состоянии. Механизмы, обеспечивающие изменение липидного состава мембран в ответ на изменения условий окружающей среды, имеют многие организмы. Лучше всего изучен механизм тепловой адаптации Е. coli.

Тепловая адаптация Е. coli. При выращивании Е. coli в условиях низких температур наблюдается изменение жирнокис-лотного состава в сторону большего содержания ненасыщенных жирных кислот. Это способствует поддержанию мембраны в текучем состоянии и позволяет клеткам выжить при экстремальных температурах. Преобладающими остатками жирных кислот в Е. coli являются пальмитоил, пальмитолеил и цис-ваксеноил. При низких температурах в бислой включается больше досваксеновой кислоты, а содержание пальмитолеиловой кислоты остается постоянным. Связано это с функционированием одного из двух ферментов, которые катализируют удлинение жирнокислотных цепей. При низких температурах фермент 3-кетоацил-АСР-синтаза II более активно превращает пальмитолеиловую кислоту в дос-ваксеновую, увеличивая пул ненасыщенных жнриых кислот, включаемых в фосфолипиды.

Адаптация к повышению давления. Жирнокнслотный состав барофильной морской бактерии NPT3 зависит от давления. При изменении давления в мембранах может также происходить фазовый переход, и эта адаптация, как и в предыдущем случае, позволяет организму выжить. При повышении давления содержание в мембранах ненасыщенных жирных кислот увеличивается, и благодаря особенностям их упаковки мембрана остается в жидкокристаллическом состоянии. Аналогичные результаты были получены при изучении фосфолипидов митохондрий из клеток печени глубоководных океанических рыб.

3. Исследования Acholeplasma laidlawii. Этот организм является микоплаэмой. У него нет клеточной стенки, а имеется единственная плазматическая мембрана. Эта особенность весьма ценна для лабораторных исследований, поскольку в мембрану могут включаться экзогенные жирные кислоты, которые легко выделять и изучать. Основными липидными компонентами являются монокглюкозилди-глицериды и диглюкозилдиглицериды. Из-за различий в размере полярной головки выделенные МГДГ образуют обратимую гексагональную фазу, а ДГДГ -- стабильный бислой. Фазовые свойства мембран A. laidlawii зависят прежде всего от соотношения между МГДГ и ДГДГ. Липнд-ный состав определяли в условиях роста организма в присутствии отдельных жирных кислот и при разных температурах или в присутствии таких агентов, как спирты и детергенты. В этих случаях объяснить адаптивную реакцию только с помощью вязкостных свойств не удается, поскольку необходимо учитывать равновесие между ламеллярной и неламеллярной фазами. Вообще говоря, анализ можно проводить, основываясь на величине параметра упаковки липидов, поскольку от него зависит фазовое состояние смеси мембранных липидов. Механизмы, с помощью которых организм адаптируется к изменяющимся условиям окружающей среды путем изменения своего липидного состава, неизвестны.

Резюме

Клетки эукариот содержат много мембранных органелл и множество различных внутриклеточных мембран, каждая из которых обладает уникальным белковым и липидным составом. Любой мембранный белок, информация о синтезе которого заключена в ядре, должен безошибочно доставляться от места синтеза на риоо-соме, находящейся в цитоплазме, к месту назначения. Для этого используется сложная система сигнальных последовательностей, содержащихся в любой зрелой форме полипептида или предшественника, а также рецепторы внутри клетки, способные эти сигналы распознавать. Некоторые мембранные белки включаются в липидный бислой самопроизвольно, но в большинстве случаев правильная сборка белка внутри клеточной мембраны является энергозависимым процессом, который осуществляется с помощью специализированного аппарата. По-видимому, белки не могут включиться в клеточную мембрану до тех пор, пока они не приобретут частично развернутую конформацию. Разворачивание белков или поддержание их в развернутой конформацин, необходимой для переноса, возможно, осуществляются при участии АТР и специфических белков в цитоплазме.

В эукариотической клетке большинство липидов синтезируется в эидоплазматическом ретикулуме, и чтобы попасть к месту назначения, они должны пройти через соответствующие мембраны. Механизм транспорта липидов неизвестен, можно лишь предположить, что в нем участвуют везикулы и белки, связывающие липиды. Способ поддержания липидного состава различных внутриклеточных мембран тоже не установлен.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8