Биосинтез 2Н-меченого инозина высокого уровня дейтерированности - рефераты, скачать рефераты, бесплатно рефераты

Рефераты. Биосинтез 2Н-меченого инозина высокого уровня дейтерированности

/p>

Выход микробной биомассы у адаптированного штамма (в) уменьшался на 13% по сравнению с контрольными условиями (рис. 2, а) при увеличении времени генерации до 2.8, а продолжительности лаг-периода до 40 ч (рис. 2, в). Адаптированный штамм возвращался к нормальному росту при переносе в протонированную среду после пролонгированного лаг-периода, что доказывает фенотипическую природу феномена адаптации, хотя теоретически не исключается, что эффект реверсии стабильно сохраняется при росте в 2Н2О, но маскируется при переносе клеток в протонированную среду. Улучшенные ростовые характеристики адаптированного метилотрофа существено упрощают схему синтеза 2Н-меченой биомассы, оптимальным условиям которой удовлетворяет максимально дейтерированная среда М9 с 98% 2Н2О и 2% [U-2Н]метанолом с инкубационным периодом 5-6 сут при 370С.

Схема синтеза 2Н-меченого инозина разрабатывалась с учетом способности метилотрофных бактерий синтезировать большое количество белка (выход 50% от веса сухого вещества), 1517% полисахаридов, 1012% липидов (в основном, фосфолипиды) и 18% зольных веществ [34]. Гидролиз биомассы проводили автоклавированием в 0.5 н. 2НCl (в 2Н2O), чтобы обеспечить высокие выходы этих соединений и минимизировать реакции обратного (1Н-2Н) обмена в аминокислотных остатках молекул белков. Качественный и количественный состав ароматических аминокислот метилотрофного гидролизата изучали в дейтерированной среде М9 на катионообменной колонке Biotronic LC-5001 (ФРГ) с сульфированной смолой UR-30, а уровни дейтерированности молекул масс-спектрометрией электронного удара метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных производных аминокислот. Гидролизат представлен пятнадцатью идентифицированными аминокислотами (за исключением пролина, который детектировался при 440 нм) при выходах аминокислот, сопоставимом с потребностями штамма в источниках углерода и аминного азота (табл. 2). При этом индикатором, определяющим высокую эффективность включения дейтерия в синтезируемый продукт служит высокий уровень дейтерированности молекул аминокислот, который варьирует от 49% для лейцина/изолейцина до 97.5% для аланина (табл. 2).

Биосинтетические характеристики штамма B. subtilis снимали в протонированной дрожжевой среде с обычной водой и синтетической тяжеловодородной среде с 2Н2О и 2% 2Н-меченым метилотрофным гидролизатом B. methylicum (рис. 3). Отмечена корреляция в характере изменения ростовых динамик (рис. 3, 1а, 2а), выхода инозина (рис. 3, 1б, 2б) и ассимиляции глюкозы (рис. 3, 1в, 2в). Максимальный выход инозина (17 г/л) зафиксирован в опыте 1б (рис. 3, 1б) на протонированной среде при уровне ассимилируемой глюкозы 10 г/л (рис. 3, 1в). На тяжеловодородной среде выход инозина снижался в 4.4 (3.9 г/л) (рис. 3, 2б), а уровень ассимиляции глюкозы в 4 раза, о чем свидетельствует 40 г/л неассимилируемой глюкозы в КЖ (рис. 3, 2в).

Таблица 2. Аминокислотный состав метилотрофного гидролизата и уровни дейтерированности молекул

Аминокислота	Выход, % от сухого веса 1 г биомассы	Величина молекулярного иона Мr	Количество включенных атомов дейтерия в углеродный скелет молекулы	Уровень дейтерированности молекул, % от общего количества атомов водорода
Глицин	9.69	324	2	90.0
Аланин	13.98	340	4	97.5
Валин	3.74	369	4	50.0
Лейцин	7.33	383	5	49.0
Изолейцин	3.64	383	5	49.0
Фенилаланин	3.94	420	8	95.0
Тирозин	1.82	669	7	92.8
Серин	4.90	355	3	86.6
Треонин	5.51	не детектировался
Метионин	2.25	не детектировался
Аспарагин	9.59	396	2	66.6
Глутаминовая кислота	10.38	411	4	70.0
Лизин	3.98	632	5	58.9
Аргинин	5.27	не детектировался
Гистидин	3.72	не детектировался

Полученный результат требовал изучение содержания глюкозы в биомассе штамма после гидролиза, осуществленное методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (табл. 3). Смесь гидролизных сахаров в табл. 3 (нумерация приведена по последовательности их элюции с колонки) составляли моно-(глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза), ди-сахариды (мальтоза, сахароза), а также четыре других неидентифицированных сахара с временами удерживания 3.08 (15.63%), 4.26 (7.46%), 7.23 (11.72%) и 9.14 (7.95%) мин (не показаны). Выход глюкозы в дейтерированном гидролизате составляет 21.4% от сух. веса, то есть выше, чем фруктозы (6.82%), рамнозы (3.47%), арабинозы (3.69%) и мальтозы (11.62%). Их выхода существенно не отличались от контроля на Н2О, за исключением сахарозы, не детектируемой в дейтерированном гидролизате.

Таблица 3. Состав сахаров гидролизата штамма-продуцента

Сахар Выход, % от сухого веса 1 г биомассы протонированная среда тяжеловодородная среда
Глюкоза	20.01	21.4
Фруктоза	6.12	6.82
Рамноза	2.91	3.47
Арабиноза	3.26	3.69
Мальтоза	15.3	11.62
Сахароза	8.62

Применение сложных физико-химических методов для выделения биосинтетически 2Н-меченого инозина из КЖ диктовалось необходимостью получать инозин высокой степени хроматографической чистоты. Поскольку в КЖ наряду с синтезируемым продуктом присутствуют примеси неорганических солей, белков и полисахаридов, а также сопутствующие вторичные метаболиты нуклеиновой природы (аденозин, гуанозин) и непрореагировавшие субстраты (глюкоза, аминокислоты), проводили ступенчатое фракционирование КЖ. Повышенная чувствительность инозина к кислотам и щелочам и его нестабильность при выделении диктовали использование кислотных и щелочных растворов низкой концентрации, а также по-возможности проводить выделение при низких температурах, избегая длительного перегрева реакционной смеси. Фракционирование КЖ заключалось в низкотемпературном осаждении высокомолекулярных примесей органическими растворителями ацетоном и метанолом, твердофазной адсорбции/десорбции на поверхности активированного угля, экстрактивного извлечения продукта, перекристаллизации и ионообменной хроматографии. Белки и полисахариды удаляли низкотемператрным осаждением ацетоном при -40С, проводя последующую адсорбцию суммы рибонуклеозидов активированным углем на холоду. Десорбированные рибонуклеозиды извлекали из прореагировавшей твердой фазы элюцией этанольно-аммиачным раствором при 600С, а сам инозин экстракцией 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН 8.9) с последующей перекристаллизацией в 80% этаноле. Окончательная стадия очистки заключалась в колоночной ионообменной хроматографии на катионообменнике AG50WX 4, уравновешенным 0.3 М NH4-формиатным буфером с 0.045 М NH4Cl с ТСХ контролем при Rf 0.5. Данные по выделению инозина из КЖ штамма-продуцента представлены в виде спектров УФ-поглощения на рис. 4, а-в. Наличие в синтетическом образце (в) основной полосы поглощения , соответствующей нативному инозину (max 249 нм, 249 7100 М-1 см-1) и отсутствие вторичных метаболитов и неоспоримо доказывает его однородность и тем самым эффективность разработанного метода выделения со степенью хроматографической чистоты 92%.

Уровень дейтерированности инозина исследовали методом масс-спектрометрии FAB из за высокой чувствительности, позволяющей детектировать 10-8-10-10 моль вещества в пробе, что существенно выше чем при использовании 1Н ЯМР-спектроскопии [7]. Пути фрагментации молекулы методом FAB приводят к распаду инозина на фрагмент рибозы А с Мr при массовом соотношении m/z 133 и гипоксантиновый фрагмент Б c Мr m/z 136 (их распад сопровождался миграцией протона Н+), который в свою очередь расщепляется на ряд менее низкомолекулярных осколочных фрагментов В, Г, Д, Е и Ж при m/z 109, 108, 82, 81 и 54 за счет элиминирования НСN и СО из гипоксантина (схема).

Биосинтетический 2Н-меченый инозин (масс-спектр приведен на рис. 5, б относительно контроля (а)), представлен смесью изотопнозамещенных форм молекул с различным количеством атомов водорода, замещенных на дейтерий. Подсчет уровня дейтерированности молекулы инозина определяли, сравнивая величины пиков молекулярных ионов Мr инозина дейтерированного и протонированного образцов (формирование пика молекулярного иона инозина сопровождалось миграцией протона Н+). Пик (М+Н)+ полиморфно расщеплялся на отдельные кластеры с примесью молекул со статистическим набором массовых чисел m/z с различным вкладом в суммарный уровень дейтерированности с включением четырех (m/z 273, 20%), пяти (m/z 274, 38%), шести (m/z 275, 28%) и семи атомов дейтерия (m/z 276, 14%) (табл. 4).

Страницы: 1, 2, 3