В случае полисахаридных гомополимеров, таких, как декстран, антигенная детерминанта может состоять из фрагментов, содержащих до восьми остатков.
Липиды, входящие в состав комплексов со многими полисахаридами, не обладают антигенной специфичностью, по-видимому, из-за высокой конформационной подвижности. Таким образом, структура полисахаридных антигенных детерминант представляет собой олигосахаридные цепи длиной 4--6 остатков, специфичность которых определяется химическим составом, типом гликозидных связей и остатками, находящимися в ближайшем окружении.
Гаптены. Гаптены -- это вещества, которые сами не вызывают иммунного ответа, но, будучи конъюгированы с носителями, обладают способностью стимулировать синтез против них антитела. Обычно принято считать, что гаптены -- это низкомолекулярные соединения, однако это не совсем верно. Например, нуклеиновые кислоты, полипептиды D-аминокислот имеют высокую молекулярную массу, но антитела против иих возникают только после коНъюгирования их с белками. В этом случае гаптены в конъюгатах с белком выступают в роли иммунодоминантной группы и поэтому в дальнейшем могут взаимодействовать с антителами независимо от белка носителя.
Структура и антигенная специфичность гаптенов определяется целым рядом факторов. В качестве гаптенов могут выступать самые разнообразные органические вещества с Мг>100. С практической точки зрения важными являются стероидные и пептидные гормоны, широкий круг лекарственных соединений, пестициды, различные продукты промышленного органического синтеза, обладающие аллергенным действием.
Антигенная специфичность гаптенов сильно зависит от их химической структуры. Так, введение дополнительных групп может сильно исказить «антигенный портрет» того или иного соединения. Например, тироксин и трийодтиронин отличаются только одним остатком I, чего вполне достаточно, чтобы антитела против этих гормонов сильно различались перекрестной реактивностью. Классическими примерами стали исследования с пара-, орто- и мета-аминобензойной кислотами, которые практически не дают перекрестных реакций при сопоставимых концентрациях.
Важным моментом является стереоспецифичность гаптенов; антитела против олигопептидов из D-аминокислот не реагируют с олигопептидами из L-аминокислот.
На антигенную специфичность сильное влияние оказывают аминокислотный остаток белка носителя, к которому пришит гап-тен, а также молекулярные размеры гаптена. Так, в длинных оли-гопептидных гаптенах замена аминокислотных остатков, которые расположены близко к белку-носителю, оказывает меньшее влияние, чем в коротких. Напротив, замены в удаленных от носителя аминокислотных остатках оказываются драматическими для антигенной структуры независимо от размеров гаптена. Аналогичны з-акономерности для олигосахаридов.
Антигенная специфичность гаптенов зависит не только от их химической структуры, но и от способа пришивки к белку-носителю, в частности от того, какая функциональная группа гаптена была использована для конъюгирования. Часто, при получении конъюгатов для иммунизации гаптены пришивают не непосредственно к молекуле белка-носителя, а через пространственную «ножку», содержащую обычно 4--6 углеродных атомов. В этом случае сама «ножка» в комплексе с гаптеном выступает в качестве составной антигенной детерминанты и образующиеся антитела могут обладать меньшей эффективностью связывания с нативным гаптеном, чем с таким связанным через «ножку» гаптеном.
В некоторых видах иммуноферментного анализа в качестве одного из реагентов используют гаптен, меченный ферментом. Если связывание в таком конъюгате аналогично способу пришивки в конъюгате гаптена с белком-иосителем для получения антител, то говорят, что в анализе используют гомологичные антитела. Если же структура «ножки» и способ пришивки гаптена в обоих случаях различны, то говорят о гетерологичных антителах. Применение того или иного вида антител или конъюгатов в иммуноферментном анализе может весьма сильно сказываться на его чувствительности и некоторых других характеристиках.
Весьма существенным фактором для специфичности является химическая структура «нодаскы», в частности ее длина и ближайшее окружение гаптена. Все эти моменты крайне важно учитывать при разработке методов иммунохимического анализа гаптенов.
Сильное влияние различных факторов на антигенную структуру и специфичность гаптенов, по-видимому, объясняется их ограниченными размерами и особенностями структуры активных центров антител.
Знание антигенной структуры и специфичности гаптенов имеет важное значение для создания методов иммунохимического определения различных физиологически активных соединений, так как многие из них претерпевают различные биохимические превращения, в результате чего образуется группа близкородственных метаболитов.
3. Общая структурная характеристика молекул иммуноглобулинов
Антитела в организме выполняют две основные функции. Первая -- это распознавание и специфическое связывание соответствующих антигенов, вторая -- эффекторная, заключающаяся в индукции важнейших физиологических процессов, направленных на уничтожение антигена: лизис чужеродных клеток через активацию системы комплемента, стимуляция специализированных иммунокомпетентных клеток, выделение фармакологически активных веществ и т.д.
Развитие иммунохимии в течение последних 25 лет позволило установить строение антител, выявить стереохимические основы их функционирования. Особое внимание было уделено изучению структуры активных центров антител, что привело к созданию полицентровой модели связывания антигена. Исследования динамических структурных свойств иммуноглобулинов способствовало установлению характера связи между антигенсвязывающими и эффекторными функциями.
Иммуноглобулины по своей химической структуре относятся к большому классу природных соединений -- гликопротеидам, высокомолекулярным соединениям, состоящим из последовательности L-аминокислот, соединенных между собой пептидными связями.
Отдельные аминокислоты отличаются между собой боковыми заместителями R. В состав белков, в том числе иммуноглобулинов, входят двадцать аминокислотных остатков.
Полипептидная цепочка за счет образования водородных связей между карбонильным атомом кислорода и атомом водорода аминогрупп отдельных аминокислотных остатков способна определенным образом укладываться в пространстве, образуя так называемые а-спиральные участки и структуру. Такая локальная упорядоченная конформация отдельных участков полипептидной цепи получила название вторичной структуры.
В целом вся полипептидная цепь образует компактную трехмерную структуру - третичную структуру: В одном растворе молекула белка сворачивается так, чтобы неполярные, или гидрофобные, боковые цепи аминокислотных остатков находились во внутренней, малодоступной для молекул воды области, а полярные, или ионизированные, группы образовывали внешний контактирующий с водой слой. Такое расположение аминокислотных остатков полипептидной цепи является термодинамическим наиболее выгодным состоянием, причем следует отметить, что это сворачивание пептидной цепи является высокоспецифичным и обусловлено первичной структурой молекулы.
Помимо рассмотренных причин сворачивания белков, обусловленных так называемыми гидрофобными взаимодействиями, определенный вклад в' стабилизацию трехмерной структуры вносят дисперсионные силы Лондона, возникающие в результате комплементарного распределения электронных облаков отдельных, рядом расположенных атомов. Энергия этого типа взаимодействий сильно зависит от расстояния между атомами и максимальна при так называемом ван-дер-ваальсовом расстоянии контакта, равном сумме ван-дер-ваальсовых радиусов взаимодействующих атомов.
Дополнительный вклад в поддержание трехмерной структуры молекул белков дают водородные и электростатические связи между боковыми группами аминокислот, а также ковалентные связи между отдельными частями полипептидной цепочки, например дисульфидные, или S--S-связи, возникающие между двумя остатками цистеина.
Некоторые молекулы белков состоят из несвязанных между собой ковалентно отдельных субъединиц. Такая пространственная организация получила название четвертичной структуры белков.
Несмотря на огромное разнообразие антител и их гетерогенность, все они обладают некоторыми общими структурными элементами, обеспечивающими выполнение их основных функций.
По своим антигенным, эффекторным свойствам и структурным особенностям иммуноглобулины подразделяются на пять основных классов: IgM, IgG, IgA, IgD и IgE.
Таблица 1 - Основные аминокислоты, входящие в состав белков
Общей структурной единицей всех иммуноглобулинов является комплекс из четырех полипептидных цепей -- двух идентичных между собой легких цепей с молекулярной массой 23000 каждая и тяжелый с молекулярной массой по 53000.
Каждая из лёгких цепей прочно соединена с концевыми участками тяжелых цепей благодаря наличию межцепочечных ди-сульфидных связей и множеству слабых гидрофобных, электростатических и других межатомных взаимодействий. Аналогичные связи существуют и между свободными участками тяжелых цепей. В целом структура такого комплекса напоминает латинскую букву «V» или «Т» и характерна для иммуноглобулинов классов IgG, IgD и IgE.
При действии протеолитического фермента папаина молекула IgG распадается на три фрагмента, два из которых идентичны и сохраняют способность связывать антигены и третий, способный к кристаллизации. Именно Fc-фрагмент ответствен за эффекторную функцию антител -- связывание белка комплемента Clq, транспорт через мембраны, взаимодействие с мембранными рецепторами и т.д.
Другой протеолитический фермент пепсин "разрывает пептидную связь, расположенную ближе к СООН-концу цепи, от S--S-связи между Н-цепями в Fc-фрагменте. В результате образуются так называемый pFc-фрагмент, представляющий собой остатки тяжелых цепей, и соединенные дисульфидными связями два Fа-фрагмента, обозначаемые как ?2-фрагмент. Последний также сохраняет способность к связыванию антигенов.
Антигенсвязывающий центр расположен в Н2-концевых частях Н- и L-цепей. Таким образом, каждая молекула IgG, а также Р2-фрагменты содержат по два антигенсвязывающих центра, а Fab-фрагмент -- один.
Необходимым условием для использования антител в иммуноферментном анализе является сохранение их способности специфически взаимодействовать с соответствующими антигенами.
Поэтому часто используют не целые молекулы антител, а только их фрагменты F2 или Fab, полностью сохраняющие эту способность. Такой подход позволяет в некоторых случаях устранить неспецифические реакции, обусловленные, в частности, взаимодействием Fc-фрагментов антител с поверхностями носителей.
Молекулы антител имеют большое число S--S-связей, которые можно разделить на 3 категории: межцепочечные связи, образуемые внутри структурной единицы между Н- и L-цепями и между Н- и Н-цепями, внутрицепочечные S--S-связи, возникающие в пределах одной и той же легкой или тяжелой цепи, и связи между Н-цепями отдельных четырехцепочечных комплексов, обусловливающих образование полимерных молекул -- IgM и IgA.
Структура иммуноглобулинов различных классов обусловлена числом и расположением S--S-связей в молекулах, а также количеством четырехцепочечных элементов. На рис. 2 приведено схематическое изображение молекул иммуноглобулинов различных классов.
IgM присутствует в сыворотке в виде пентамера четырехцепочечных комплексов, соединенных S--S-связями между Н-цепями. Некоторое количество IgA сыворотки также присутствует в виде димерной и тетрамерной формы. Полимерные IgA и IgM содержат Небольшую полипептидную цепь с Мг=14 000--15000, которая, по-видимому, стабилизирует полимерную структуру. Кроме того, в димерный IgA входит секреторный компонент--большой гликопротеид с Мг=80 000.
Легкие цепи иммуноглобулинов бывают только двух типов --К или х. и являются общими для всех пяти классов, в то время как тяжелые цепи обладают структурными, иммунологическими и химическими особенностями, характерными для каждого класса иммуноглобулинов.
Для обозначения тяжелых цепей, относящихся к классам IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, используют соответствующие греческие буквы-- у, ц, а, б и е. На основании различий в химическом строении Н-цепей в пределах класса можно выделить подклассы иммуноглобулинов: 4 -- для IgG, 2 -- для IgA и 2 -- для IgM. В молекуле иммуноглобулина любого класса легкие цепи относятся только к одному типу.
Страницы: 1, 2
