В даний час можна спостерігати з високим дозволом навіть внутрішні деталі тривимірних структур, таких, як віруси. Для цього використовують метод кріоелектроної мікроскопії, де дуже тонкий (приблизно 100 нм), швидко заморожений шар вологого зразка поміщають на мікроскопічні ґрати. За допомогою спеціального пристосування гідратований зразок утримують при - 160сС у вакуумі мікроскопа. Таким способом можна спостерігати матеріал практично безпосередньо: без фіксації, фарбування і сушіння.

При біохімічному аналізі використовують такі методи дослідження, як гібридизація, імуноцитохімія з застосуванням моноклінних антитіл на електронно-мікроскопічному рівні. За допомогою біохімічних методів вивчали АТФ-синтетазні комплекси внутрішньої мембрани.

Хоча дослідження мітохондрій у живій клітині пов'язано з відомими труднощами через те, що вони мають низький показник переломлення, їх усе-таки можна легко спостерігати в культурах тканини in vitro, зокрема під фазово-контрастним мікроскопом або в темному полі звичайного мікроскопа.

При фазово-контрастному та інтерференційному мікроскопуванні проходження світла через живу клітку фаза світлової хвилі міняється відповідно до коефіцієнта рефракції клітки: світло, яке проходить через відносно тонкі або відносно товсті ділянки клітки, затримується, і його фаза відповідно зрушується стосовно фази світла, яке проходить через відносно тонкі ділянки цитоплазми. Як у фазово-контрастному, так і в інтерференційному мікроскопі використовуються ефекти інтерференції, які виникають при рекомбінації двох наборів хвиль, що і створюють зображення клітинних структур. Обидва типи світлової мікроскопії широко використовуються для спостереження живих клітин.

Найпростіший спосіб розглянути деталі клітинної структури - спостерігати світло, яке розсіюється різними компонентами клітини. У темнопольному мікроскопі промені від освітлювача направляються збоку і при цьому в лінзи мікроскопа попадають тільки розсіяні промені. Відповідно клітина виглядає як освітлений об'єкт на темному полі. Одним з основних переваг фазово-контрастної, інтерференційної і темнопольной мікроскопії є можливість спостерігати рух клітин у процесі мітозу і міграції.

Високий контраст, який досягається за допомогою комп'ютерної інтерференційної мікроскопії, дозволяє спостерігати навіть дуже дрібні об'єкти.

За допомогою мікроманіпулятора було встановлено, що мітохондрії являють собою відносно стабільні утворення, які можна, неушкоджуючи, переміщати мікроголкою усередині клітини. Їх питома вага вище питомої ваги цитоплазми. Під час ультрацентрифугування живих клітин при 200000-400 000 g мітохондрії накопичуються у відцентрового полюса в неушкодженому виді.

Зміна об'єму і форми in vivo. Прижиттєві спостереження становлять особливий інтерес тоді, коли вони доповнюються цейтраферною мікрокінозйомкою. У культурі фібробластів можна спостерігати безперервні і часом ритмічні зміни об'єму, форми і розподілу мітохондрій. У русі мітохондрій розрізняють два основних типи: коливальні рухи і переміщення з однієї частини клітини в іншу, причому під час інтерфази вони значно більш активні, чим протягом мітозу. Іноді ці органоїди прикріплюються до оболонки ядра найближче до ядерця. Нитковидні мітохондрії можуть розпадатися на гранули, які здатні знову об'єднуватися в нитки. У деяких випадках рух мітохондрій зовсім пасивний й обумовлюється плином цитоплазми.

Різкі зміни об'єму і форми мітохондрій можуть викликатися хімічними, осмотичними і механо-хімічними реакціями. У живих клітинах спостерігаються цикли скорочень з малою амплітудою, які пов'язані з процесом окисного фосфорилювання. Відомо, що ціаністі сполуки, динітрофенол і інші інгібітори окислювання викликають набрякання, а надлишок АТФ - скорочення мітохондрій. Ці явища відбуваються і при зміні осмотичного тиску середовища. Неорганічний фосфат, відновлений глутатіон, Са2+ і жирні кислоти викликають набрякання, а дія АТФ запобігає цьому. Явище скорочення обумовлюється наявністю в мітохондріях скорочувального білка, аналогічного актоміозину м'язів. Більшої амплітуди змін об'єму можна досягти шляхом одночасного застосування декількох факторів (найбільш ефективними є Са2+ і тироксин) . Можливо, що набряканням мітохондрій, яке приводять до роз'єднання процесів окислювання і фосфорилювання, пояснюється фізіологічна дія цього гормону при гіперфункції щитовидної залози. Інші гормони, у тому числі гормон росту, окситоцин, вазопресин, інсулін і деякі кортикостероїди, також викликають набрякання мітохондрій. Крім того, це явище спостерігається і при патологічних станах організму, обумовлених, наприклад, впливом канцерогенів і токсинів.

Фіксація і фарбування. Вітальне і суправітальне дослідження мітохондрій значно полегшується при фарбуванні їх слабкими розчинами януса зеленого, у якому вони набувають зеленувато-синього кольору. Таке фарбування пояснюється присутністю в мітохондріях цитохромоксидазної системи, яка підтримує барвник в окисленій (зафарбованій) формі. У навколишній цитоплазмі барвник відновлюється до безбарвної лейкоформи.

Уже давно відомо, що мітохондрії досить лабільні і легко ушкоджуються під дією фіксаторів. Тому всі методи фіксації мітохондрій засновані на стабілізації їх ліпопротеїдної структури шляхом тривалої дії окисних агентів (оксид осмію(IV), хромова кислота і біхромат калію). Як барвник застосовують залізний гематоксилін або кислий фуксин Серед цитохімічних методів фарбування мітохондрій, слід виділити такі, як реакція наді на цитохромоксидазу або застосування різних сполук тетразолію, які утворють за участю дегідрогеназ мітохондрій нерозчинні хромогени (формазан). Подібні цитохімічні дослідження проводилися і з використанням електронного мікроскопа, причому для виявлення сукцинатдегідрогенази застосовувався телурит калію, а для виявлення сукцинат- і НАД-Н2-дегідрогеназ - нітросиній тетразолій і тетранітро-синий тетразолій. Виявилося, що локалізація продуктів реакції в мітохондріях тісно зв'язана з локалізацією крист.

РОЗДІЛ 3. ДОСЛІДЖЕННЯ МІТОХОНДРІЙ НА СУЧАСНОМУ ЕТАПІ

Таблиця 3.1

У 1999 році приділялась увага кількісним морфологічним характеристикам трьох типів мітохондрій у зрілих кардіоміоцитах крис. Встановлено існування двох режимів роботи мітохондріального апарату в залежності від локалізації та стану міофібрилярного апарату. Проведена оцінка кількісного відношення між типами органел на етапах онтогенезу. В цьому ж році був виділений коливальний характер рівня дихання культури та зміна ультраструктури мітохондрій. Відмічено два піка підйому інтенсивності дихання - на початковому етапі дії кліностатування і в кінці логарифмічної фази росту культури, які співпадають з періодами перерозподілу популяції. Підвищення інтенсивності дихання клітин та зміна ультраструктури направлені на стимуляцію метаболізму клітин в процесі адаптації до умов навколишнього середовища.

У 2001 році у частині казусних клітин гороху поряд з мітохондріями типової організації були виявлені гігантські органели. Їх оболонка як і у мітохондрій складається з двох біологічних мембран, з яких внутрішня утворює інвагінації. Специфічною особливістю структурної організації незвичайних мітохондрій є наявність включень у їх матриксі. Останні мають вигляд електронно щільного тяжу, що складається з фібрилоподібних утворень і простягається паралельно повздовжньої вісі органел.

У 2002 році в експерименті на 66 білих пацюках вивчена дія низькочастотної вібрації на популяцію мітохондрій нейронів сенсорної кори. Результати досліджень показали етапність реакції мітохондріальної популяції на дію низькочастотної вібрації; схожість структурних перебудов мітохондрій при дії вібрації та гіпоксії; перехід до одноманітності структурно-функціональних характеристик мітохондрій в популяції в динаміці низькочастотної дії.

Також проводились роботи щодо вивчення еволюції мітохондрій. Результати сіквенсу мітохондріальних геномів свідчать про монофілетичне походження мітохондрій від еубактеріального предка, який відноситься до підрозділу б-протеобактерій. Протягом останніх років були визначені повні послідовності великої кількості мітохондріальних та еубактеріальних геномів. Ці результати свідчать про те, що мітохондріальний геном еволюціонував від одного предка, загального для всіх існуючих на даний час еукаріотів, та що мітохондріальна та ядерна компоненти еукаріотичної клітини виникли одночасно.

В 2003 році на прикладі представника з родини Пасльонових Salpiglossis sinuata був запропонований новий підхід щодо створення пластомних трансформантів. В результаті експериментів були отримані морфологічно подібні з Salpiglossis sinuata рослини стійкі до стрептоміцину. Аналіз показав, що отримані рослини містять трансформований пластом Salpiglossis sinuata, а мітохондріальна ДНК отриманих рослин відрізняється від обох батьківських.

На основі проведеного аналізу можна сказати, що на сучасному етапі дослідження мітохондрій проводяться в багатьох вузьких, глибоко специфікованих напрямках, які стосуються впливу зовнішніх умов на будову і функції мітохондрій, особливостей роботи ферментного апарату, генетики і еволюції мітохондрій.

ВИСНОВКИ

1. Проведено огляд літературних джерел на основі яких з'ясовано особливості будови та функції мітохондрій, їхню роль в забезпечені клітин енергією.

2. Визначені особливості генетичної системи мітохондрій, її структура та особливості генетичного коду, визначено межі її автономності.

3. Розглянуто теорії походження мітохондрій та основні шляхи їх успадковування.

4. З'ясовані основні методи дослідження мітохондрій, і, як бачимо, вони представлені методами генетики, цитології, молекулярної біології і біохімії.

5. Проведено аналіз сучасних українських наукових досліджень, які проводились з мітохондріями.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. В 5-ти томах. М.: Мир, 1986 - 1987.

2. Заварзин А.А, Харазова А.Д., Молитвин М.Н. Биология клетки: Общая цитология: Учебное пособие для биол. спец. высших учебн.заведений. - Спб.:Из-во С. - Петербург. Ун-та, 1992. - 318 с.

3. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология. В 3-х т. М.: Мир, 1982. - 342 с.

4. Ленинджер А. Митохондрия. - М.: Мир, 1966. - 315 с.

5. Марченко А.І. Цитологія: Навчальний посібник для ден. Та заоч. Відділення природничо-географічного факультету / Ніжин, 2003. - 66 с.

6. Ченцов Ю.С. Общая цитология: [Учебное пособие для биолог. спец. вузов] - 2-е изд., М.: Из-во МГУ, 1984. - 350 с.

7. Э.де Робертис, В. Новинский, Ф. Саэс. Биология клетки. - М.: Мир, 1967. - 473 с.

Страницы: 1, 2, 3, 4