таксонами
Дифференцирующие признаки родов аспорогенных грамположительных палочек правильной формы изложены в определителе бактерий Берджи (1997).
7. Среды для выделения и первичной идентификации
Выделение культуры и ее идентификация являются необходимыми для окончательного подтверждения диагноза листериозной инфекции. Для выделения листерий из клинического материала и продуктов питания используют селективные факторы. Наибольшее значение имеют температурный фактор и селективные добавки. Метод холодового обогащения при температуре +4oС, основанный на психрофильности листерий, весьма эффективен, но из-за длительных сроков инкубации (10-60 дней) не может быть рекомендован для клинической диагностики. В современных схемах выделения листерий обычно используют инкубацию при температуре 30oС в течение 24-48 ч в бульоне с селективными добавками для обогащения исследуемого образца (Тимаков, 1983).
Среди широкой гаммы селективных агентов, использовавшихся в разное время для выделения листерий, наибольшее значение сохраняют ингибиторы сопутствующей микрофлоры и дифференцирующие индикаторы: теллурит калия, налидиксовая кислота, хлорид лития, акрифлавин, эскулин, красители (фенилрот), антибиотики (цефтазидим, полимиксин B), циклогексимид (Тартаковский, 2002).
Наибольшее распространение для выделения листерий получили Оксфорд агар и PALCAM агар. В состав Оксфорд агара входят следующие селективные добавки (в г/л): эскулин - 1,0; цитрат железистого аммония - 0,5; хлорид лития - 15,0; циглогексимид - 0,4; колистин - 0,02; акрифлавин - 0,005; цефотетан - 0,002; фосфомицин - 0,01. В состав PALCAM агара входят (в г/л): эскулин - 0,8; цитрат железистого аммония - 0,5; хлорид лития - 15,0; акрифлавин - 0,005; полимиксин В - 0,01; цефтазидим - 0,02; фенилрот - 0,08 (Кареткина, 2008).
В качестве обогатительного бульона обычно используют различные варианты триптиказосоевого бульона с дрожжевым экстратом и селективным компонентом, включающим солянокислый акрифлавин (0,02-0,01 г/л), налидиксовую кислоту (0,05-0,01 г/л) и циклогексимид (0,05-0,01 г/л).
Схемы выделения листерий в зависимости от степени контаминации и количества листерий в исследуемом материале включают либо непосредственный высев на селективный агар, либо обогащение исследуемого образца на селективном бульоне при температуре 30oС в течение 24-48 ч с последующим высевом на селективный агар (Поздеев, 2006).
На Оксфорд агаре вырастают черные колонии L.monocytogenes, окруженные черным ореолом.
На PALCAM агаре колонии листерий серо-зеленые с черным вогнутым центром (рис. 3). Для них также характерен черный ореол на красном фоне агара. Последующий анализ характерных колоний, утилизирующих эскулин (в результате чего и происходит почернение среды), позволяет на основании ограниченного числа тестов идентифицировать культуру L.monocytogenes (Черкасский, 2002).
Весьма информативен САМР-тест, в котором культура L.monocytogenes дает положительную реакцию, образуя зону усиления гемолиза с гемолитическим штаммом Staphylococcus aureus и, в большинстве случаев отрицательную с Rhodococcus equi на чашках с кровяным агаром. Для идентификации листерий в качестве дополнительных тестов используют агглютинацию с поливалентной листериозной сывороткой и фаготипирование с помощью диагностичесого набора типовых листериозных бактериофагов (L2A и L4A), лизирующих 60-80% выделенных культур листерий (Тартаковский, 2002).
8. Внутривидовая и межвидовая идентификация
Дифференцирующие признаки видов рода Listeria представлены в определителе Берджи (1997)
Особое значение имеют тесты, позволяющие идентификацию L.monocytogenes совместить с дифференциацией от других непатогенных для человека листерий (рис. 5). L.monocytogenes формирует рамнозу и не утилизирует ксилозу и маннит, обладает гемолитической активностью на кровяном агаре (Тартаковский, 2002).
Анализ серологической структуры листерий показал, что она крайне неудобна для диагностики. Серотипы листерий не являются видоспецифическими. Они могут быть общими для разных видов листерий, независимо от их патогенности для человека. В сочетании с традиционной для серологических методов исследования относительно низкой чувствительностью и специфичностью, ретроспективным характером диагностики и широким распространением бактерионосительства при листериозе этот недостаток значительно снижает область применения серологических методов. L.monocytogenes имеет одну или несколько общих антигенных детерминант с другими видами листерий, кроме L.welshimeri. Поэтому само по себе установление серотипа без применения иных методов не позволяет установить диагноз инфекции, вызванной L.monocytogenes (Черкасский, 2002).
Наиболее перспективным для серологической диагностики представляется определение антител к секретируемому фактору патогенности листерий - листериозину О. Но даже эту более специфичную методику авторы рекомендуют использовать только для выявления неинвазивных бессимптомных форм болезни при эпидемических вспышках листериоза (Кареткина, 2008)
9. Способы ускоренной индикации в объектах внешней среды и в
организме животного
Практически весь спектр современных методических подходов пытались использовать для ускоренного выявления листерий: иммунофлюоресценцию, иммуноферментный анализ, моноклональные антитела, радиоиммунологический метод, ДНК-зонды, ПЦР, проточную цитометрию и др. Однако в клинической диагностике листериоза они не нашли применения (Радчук, Дунаев, 1991).
Основная область использования экспресс-методов - выявление листерий в продуктах питания. Однако и здесь приоритет в соответствии с международными и национальными регламентами стран - экспортеров продовольствия принадлежит классической бактериологии, хотя в дальнейшем поиск новых высокоспецифичных антигенных и нуклеотидных маркеров может изменить ситуацию (Тартаковский, 2002).
При анализе клинического материала (ликвора, крови, околоплодной жидкости, плаценты) перспективно применение ПЦР с использованием праймеров на основе последовательностей гена листериозина О (hly) или фосфолипазы (plcA). Метод обладает высокой чувствительностью и позволяет выявить возбудитель в течение нескольких часов. Хотя фрагмент хромосомы, на котором расположены гены, кодирующие факторы патогенности L.monocytogenes, используемые в ПЦР, сходен с аналогичным фрагментом L.ivanovii и L.seeligeri, в наших экспериментах мы не наблюдали перекрестных реакций. Однако опыт применения ПЦР при анализе клинического материала недостаточен для практических рекомендаций по его использованию в качестве основного метода диагностики (Поздеев, 2006).
10. Медицинское и ветеринарное значение. Патогенность
Патогенные листерии обладают набором биологически активных молекул и белков (листериолизин О, фосфолипаза С, лецитиназа, интерналин, белки ActA и PrfA), позволяющим активно проникать и размножаться не только в фагоцитах, но и эндотелиальных и эпителиальных клетках. Способность перемещаться по цитоплазме клетки за счет полимеризации актина и переходить из клетки в клетку «продавливая» мембрану позволяет патогенным листериям легко преодолевать барьеры слизистой оболочки кишечника без контакта с антителами, комплементом и нейтрофилами. Поступая в кровяное русло возбудитель может перемещаться в главные места локализации поражая мозг и плаценту (Литвин, 1996).
Если раньше листериоз считали типичным зоонозом, при котором источником возбудителя инфекции являются различные животные, то в настоящее время его относят к сапрозоонозам, а основным источником и резервуаром возбудителя инфекции признаны объекты внешней среды, природные субстраты, в которых листерий способны размножаться -- прежде всего почва. Листерий выделяют также из растений, силоса, пыли, водоемов и сточных вод (Кареткина, 2008).
Основной путь заражения человека листериозом -- пищевой; люди заражаются при употреблении вышеперечисленных продуктов питания, не прошедших термической обработки. Повышенную опасность представляют мягкие сыры, а также продукты быстрого приготовления (“фаст фуд”)--сосиски "хот-дог", гамбургеры и др. Возможны также другие пути заражения: контактный (от инфицированных животных и грызунов), аэрогенный (в помещениях при обработке шкур, шерсти, а также в больницах), трансмиссивный (при укусах насекомых, в частности клещей), половой. Особое значение имеет возможность передачи листерий от беременной женщины плоду -- либо во время беременности (трансплацентарно), либо при контакте новорожденного с родовыми путями родильницы (интранатально). Листерий могут быть причиной внутрибольничной инфекции. У животных возбудители в основном передаются алиментарпым путем; менее действенный путь передачи инфекции -- трансмиссивный (при укусах клещей) (БМЭ,1980).
В человеческой популяции частота бессимптомного носительства листерий составляет 2--20%; из кала здоровых людей листерий выделяют в 5--6% случаев. В России ежегодно выявляется от 40 до 100 больных. В Москве в 1992 г. листериоз диагностирован только у 9 человек, в 1999 г. -- у 23, в 2001 г. -- у 25 (преимущественно у детей). По данным эпидемиологов, в Москве заражение происходит чаще всего (более чем в 50% случаев) контактным путем от инфицированных животных (собак, кошек) и грызунов, реже (около 30% случаев) -- пищевым и перинатальным (около 15 %) путями. Заболеваемость носит преимущественно спорадический, реже -- групповой характер (Кареткина, 2008).
Листерий проникают в организм человека через слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта, органов дыхания, глаз, половых путей, поврежденную кожу, передаются через плаценту плоду. При адекватной иммунной реакции организма, продукции достаточного количества субпопуляций Т-лимфоцитов, активации макрофагов дальнейшего продвижения листерий не происходит. В противном случае из входных ворот микробы могут распространяться гематогенно и лимфогенно (Черкасский, 2002).
Прогрессирование процесса вызывает некротические изменения в центре гранулем. В дальнейшем происходит организация некротических очагов, рассасывание некротизированных клеточных элементов с возможным рубцеванием. Специфические гранулемы могут быть в любых органах, но чаще всего обнаруживаются в печени. Листерий способны преодолевать гематоэнцефалический барьер, поражать как оболочки, так и вещество головного мозга, мозжечка, где развивается воспалительная реакция и нередко формируются субкортикальные абсцессы. При врожденном листериозе гранулематозный процесс носит генерализованный характер и трактуется как гранулематозный сепсис. При наружном осмотре новорожденного с листериозом выявляются множественные беловато-сероватые гранулемы диаметром 1--2 мм, в части случаев -- сыпь на коже-- папулезная с геморрагическим венчиком или розеолезная. На вскрытии умерших от листериоза все органы с поверхности или на разрезе как бы посыпаны "пшеном" -- беловато-сероватые, серовато-желтоватые гранулемы обнаруживаются под плеврой, в легких, под капсулой печени и в ее ткани, в почках под мягкой мозговой оболочкой, в веществе головного мозга, в селезенке, лимфатических узлах, кишках желудке, надпочечниках, тимусе. Микроскопически в коже наблюдаются продуктивные васкулиты, очажки некроза в дерме с образованием гранулем, гиперемия. В печени выявляются множественные субмилиарные очаги некроза гепатоцитов с выраженной гиперплазией и пролиферацией звездчатых эндотелиоцитов, на месте которых формируются описанные гранулемы. При пероральном заражении животных в инкубационном и остром периодах находят возбудителя в групповых (пейеровых) бляшках, лимфатических фолликулах, в лимфатических узлах корня брыжейки и даже в печени и селезенке; отмечается поражение печени с некротическими очагами (Тимаков, 1983).
Необходимо раннее назначение антибактериальной терапии. При локализованной (железистой, гастроэнтеритической) форме используются ампициллин (амоксициллин), ко-тримоксазол, эритромицин, тетрациклин (доксициклин), левомицетин в средних терапевтических дозах. При генерализации инфекции (нервная, септическая формы), листериозе новорожденных рекомендуется сочетание ампициллина (взрослым -- 8--12 r/сут; детям -- 200 мг/кг/сут) или амоксициллина с гентамицином (5 мг/кг/сут) в течение всего лихорадочного периода и еще 3--б дней, а в тяжелых случаях--до 2--3 нед. с момента нормализации температуры. В случае неэффективности такой терапии необходимо заменить антибиотик с учетом чувствительности штамма листерии. выделенного от больного. При необходимости проводят инфузионную дезинтоксикационную, а также десенсибилизирующую и симптоматическую терапию, лечение сопутствующих заболеваний. Беременным назначают ампициллин. Женщине, родившей больного листериозом ребенка, проводят курс антибактериальной терапии ампициллином или доксициклином (2 цикла по 7--10 дней с интервалом в 1,5 мес) (Поздеев, 2006).
Профилактика листериоза включает в себя контроль за пищевыми продуктами, предусмотренный соответствующими нормативными документами; санитарно-просветительную работу среди населения, особенно в группах риска. Из рациона беременных женщин следует исключить продукты пищевой индустрии для быстрого питания, не прошедшие длительной термической обработки, а также брынзу, мягкие сыры и сырое молоко. Для профилактики листериоза новорожденных необходимо обследовать женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом, а также имеющих постоянный контакт с животными. Женщины с выявленным листериозом, клинически манифестным или бессимптомным, подлежат специфической терапии (Кареткина,2008).
Таким образом, в России, как и во многих других странах мира, в настоящее время заболеваемость листериозом растет, причем заболевают не только пожилые люди, лица с различными сопутствующими заболеваниями, но и молодые и здоровые. Листериоз характеризуется полиморфной клинической симптоматикой, поэтому пациенты могут обращаться к врачам разных специальностей (терапевтам, гастроэнтерологам, невропатологам, акушерам-гинекологам и др.). При своевременно начатой и адекватной анти-биотикотерапии болезнь излечима (Черкасский, 2002).
11. Экология и распространение
Листерии широко распространены во внешней среде. Встречаются в почве, воде, растениях. Чаще всего листерии выделяли из почвы тех полей, где травы не скашивались несколько лет, поскольку увядшая и разложившаяся трава способствует их размножению (Тимаков, 1983).
Способность листерий размножаться в почве зависит от температуры, содержания гумуса, влажности и величины pH. Листерии живут в достаточно широком температурном диапазоне (3-45 °С). Листерии -- психрофилы, то есть, способны к активному размножению при низких температурах (4-10 °С). Поэтому их численность активно увеличивается весной и осенью, летом же в почве отмечается значительное уменьшение концентрации листерий. Зимнее промерзание почвы не оказывает отрицательного влияния на их жизнеспособность. Листерии требовательны к наличию в почве органических веществ. Они размножаются и длительно сохраняются в почвах с высоким процентом гумуса. В хвойных лесах они отсутствуют. Быстро погибают в пустынных и песчаных почвах. Водный баланс почвы также весьма важен для листерий. В кислых почвах листерии не размножаются, для них оптимальны значения pH, близкие к нейтральным (Поздеев,2006).
Листерии выделяют также из сточных вод, речной воды, ила, навозной жижи. Жизнеспособность листерий в воде зависит как от величины pH, так и от жёсткости воды. Листерии способны проникать в вегетативные органы растений через корневую систему и сохраняться там в высокой концентрации в течение месяца. Таким образом, листерии способны адаптироваться к существованию в широком диапазоне условий внешней среды. Им свойственна высокая метаболическая пластичность, способность перехода от сапрофитического образа жизни к паразитическому, и наоборот.
12. Применение в практике
Приведенные данные свидетельствуют о "многоликой" роли листерий в инфекционной патологии человека и необходимости дальнейшего совершенствования санитарно-эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики листериоза в России. Быстрый прогресс в этой области может быть достигнут преимущественно в результате объединения усилий в организаторской работе бактериологов, эпидемиологов и специалистов в области гигиены питания на следующих ключевых направлениях (Тартаковский, 2002):
1) налаживание производства отечественных селективных сред для выделения листерий (PALCAM агар, Оксфорд агар, накопительный бульон) и других реагентов, необходимых в современных схемах выделения и идентификации L.monocytogenes в соответствии с международными стандартами;
2) регламентирование показателя L.monocytogenes для сыра и продуктов животного происхождения в качестве гигиенического требования, предъявляемого к качеству и безопасности пищевых продуктов, и внедрение его в практику текущего санитарно-эпидемиологического надзора; критерий безопасности - L.monocytogenes не допускается в 25 г продукта;
3) осуществление комплекса мероприятий, по профилактике листериоза у беременных, включающих бактериологическое обследование на листериоз, особенно в случаях отягощенного акушерского анамнеза, выполнение рекомендаций по питанию, исключающих потребление продуктов, в которых наиболее вероятно размножение листерий.
Заключение
Морфологически листерии представляют собой мелкие кокковидные палочки длиной 0,5--2 мкм и шириной 0,4--0,5 мкм, факультативные аэробы, хорошо, но не обильно развиваются на обычных нейтральных или слабощелочных (при рН 7,0--7,2) мясопептонных средах, пышно растут при добавлении в среды глюкозы или сыворотки. Листерии ферментируют глюкозу, каталазоположительны, оксидазоотрицательны, образуют цитохромы. Листерии некислотоустойчивы. Не образуют споры и капсулы, факультативные анаэробы, хемоорганогетеротрофы.
Практически весь спектр современных методических подходов пытались использовать для ускоренного выявления листерий: иммунофлюоресценцию, иммуноферментный анализ, моноклональные антитела, радиоиммунологический метод, ДНК-зонды, ПЦР, проточную цитометрию и др. Однако в клинической диагностике листериоза они не нашли применения
Список литературы
1. Литвин В.Ю., Емельяненко Е.Н., Пушкарева В.И. Патогенные бактерии, общие для человека и растений: проблемы и факты / В.Ю. Литвин , Е.Н. Емельяненко , В.И. Пушкарева // Микробиология, 1996.- №2.-С.76-83.
2. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / О.К. Поздеев - М.: FЭOTAP-Медиа, 2006.- с.302-310.
3. Радчук Н.А, Дунаев Г.В. Ветеринарная микробиология и иммунология / Радчук Н.А, Дунаев Г.В.-М.: Агропромиздат,1991.-с.202-205.
4. Тартаковский И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика / И.С. Тартаковский.-М.: Наука, 2002.- с.130-145.
5. Тимаков В.Д., Левашев В.С. Микробиология / В.Д. Тимаков, В.С. Левашев.-М.:Медицина, 1983.- с.344-349.
6. Черкасский Б.Л. Частная эпидемиология / Б.Л. Черкасский.-М.: «Интерсэн», 2002.- с. 354-359.
7. БМЭ/ под редакцией Б.В. Петровского. - М.: Советская энциклопедия, 1980.- с. 200-205.
Страницы: 1, 2
