Содержание ДНК в органах и тканях животных и человека колеблется в широких пределах и, как правило, тем выше, чем больше клеточных ядер приходится на единицу массы ткани. Особенно много ДНК (около 2,5% сырого веса) в вилочковой железе, состоящей главным образом из лимфоцитов с крупными ядрами. Довольно много ДНК в селезенке (0,7--0,9%), мало (0,05--0,08%) в мозге и мышцах, где ядерное вещество составляет значительно меньшую долю. На ранних стадиях эмбрионального развития в этих органах содержится больше ДНК, но содержание ее уменьшается в процессе онтогенеза по мере дифференцировки. Однако количество ДНК на одно клеточное ядро, содержащее диплоидный набор хромосом, практически постоянно для каждого биологического вида. Соответственно количество ДНК в ядрах половых клеток вдвое ниже. По этой же причине различные физиологические и патологические факторы почти не влияют на содержание ДНК в тканях, а при голодании, например, относительное содержание ДНК даже возрастает за счет снижения концентрации других веществ (белков, углеводов, липидов, РНК). У всех млекопитающих количество ДНК в диплоидном ядре почти одинаково и составляет около 6 1012 г, у птиц -- около 2,5 10-12, у разных видов рыб, амфибий и простейших оно колеблется в значительных пределах.
Содержание ДНК в бактериях довольно велико и достигает нескольких процентов в пересчете на сухой вес; в вирусах оно может доходить до 50%. Вместе с тем абсолютное количество ДНК в бактериальной клетке в среднем на два порядка ниже, чем в клеточном ядре высших организмов, а в ДНК-содержащих вирусах оно ниже еще на два порядка.
У бактерий одна гигантская молекула ДНК образует генофор, соответствующий хромосоме высших организмов. Так, у кишечной палочки Escherichia coli молекулярный вес такой кольцеобразной двуспиральной молекулы достигает около 2,5-Ю9 и длины, превышающей 1,2 мм. Эта огромная молекула плотно упакована в небольшой «ядерной области» бактерии и соединена с бактериальной мембраной.
В хромосомах высших организмов (эукариотов) ДНК находится в комплексе с белками, главным образом гистонами; в каждой хромосоме содержится, по-видимому, одна молекула ДНК длиной до нескольких сантиметров и молекулярным весом до нескольких десятков миллиардов. Такие огромные молекулы умещаются в клеточном ядре и в митотических хромосомах длиной в несколько микрометров. Часть ДНК остается не связанной с белками; участки несвязанной ДНК перемежаются с блоками ДНК, связанной с гистонами. Показано, что в таких блоках содержится по две молекулы гистонов 4 типов: Нда, Hab, Hg и Н4.
Помимо клеточного ядра, ДНК содержится в митохондриях и в хлоропластах. Количество такой ДНК обычно невелико и составляет небольшую долю общей ДНК клетки. Однако в ооцитах и на ранних стадиях эмбрионального развития животных подавляющая часть ДНК локализована в цитоплазме, главным образом в митохондриях. В каждой митохондрии содержится по поскольку молекул ДНК. У животных мол. вес митохондриальной ДНК составляет около 10-106; ее двуспиральные молекулы замкнуты в кольцо и находятся в двух основных формах: сверхскрученной и открытой кольцевой. В митохондриях и в хлоропластах ДНК не находится в комплексе с белками, она ассоциирована с мембранами и напоминает бактериальную ДНК Небольшие количества ДНК обнаружены также в мембранах и некоторых других структурах клеток, однако их особенности и биологического роль остаются неясными.
6. Биосинтез
В процессе биологического синтеза ДНК на матрице аналогичной молекулы ДНК образуется такая же молекула, и количество ДНК удваивается. Поэтому процесс биосинтеза ДНК получил название редупликации или репликации.
Принцип комплементарности (дополнительности), по Уотсону и Крику, заложен в самом строении: ДНК.
Дж. Уотсоном и Ф. Криком было постулировано, что репликация ДНК должна происходить полуконсервативным способом, то есть путем раскручивания двойной спирали и синтеза новых, комплементарных исходной полинуклеотидных цепочек на каждой нити. Именно этот механизм и был доказан экспериментально путем введения в ДНК-матрицу тяжелого азота (радиоактивной метки) и анализа ДНК последующих поколений при помощи центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия или методом авторадиографии.
ДНК синтезируется из дезоксинуклеозидтрифосфатов, которые соединяются в полинуклеотидную цепь с отщеплением пирофосфата. Эта реакция протекает на матрице одноцепочечной предобразованной ДНК под действием фермента ДНК-полимеразы, причем синтезирующаяся: дезоксирибополинуклеотидная цепь дочерней ДНК строго комплементарна матричной цепи. ДНК-полимераза, впервые выделенная из Е. coli, хорошо изучена. Ее молекулярный вес составляет 110 000 дальтонов, под действием трипсина она распадается на 2 фрагмента -- активный и неактивный. Для протекания реакции, катализируемой ДНК-полимеразой, необходимы матричная ДНК, обязательное присутствие всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и ионов Mg2+. Равновесие реакции сильно смещено в сторону синтеза, оптимальная величина рН 7,5; реакция ингибируется пирофосфатом: концентрация пирофосфата 2*10-3 М угнетает реакцию синтеза на 50%. Показано, что двуспиральная молекула ДНК неактивна в качестве матрицы, однако для инициации репликации на активной матрице одноцепочечной ДНК необходим участок комплементарной ей полинуклеотидной цепи со свободным 3'-ОН-кон-цом рибозы, служащий затравкой для роста вновь синтезирующейся цепи. Эта затравка состоит из рибонуклеотидных остатков, которые удаляются по завершении синтеза комплементарной цепи ДНК. К 3'-ОН-концу затравки ДНК-полимераза последовательно присоединяет дезокспрпбонуклеотидные остатки, соединяющиеся водородными связями с комплементарными основаниями матричной цепи. Рост синтезирующейся цепи происходит в направлении 3'-ОН -- 3'-ОН-концам, антипараллельно матричной цепи. Репликация ДНК приводит к удвоению количества генетического материала клетки и, как правило,-- к клеточному делению. Поэтому репликация происходит тем чаще, чем короче время генерации вируса или бактерии и чем чаще делятся клетки у высших организмов. Темп репликации высок у эмбрионов, в особенности во время дробления, и замедляется по мере развития и дифференцировки. Вообще темп репликации соответствует митотической активности ткани и поэтому низок в не делящихся клетках, например в клетках мозга пли мышц, и относительно высок в часто делящихся клетках костного мозга или опухолей. Репликация ДНК имеет место и при эндомптозах, приводящих к полиидоидизации ядер. Репликация происходит не во время собственно митоза, а в интеркинетической фазе во время синтетического S-периода клеточного цикла между периодами gi и Ga.
У бактерий и вирусов репликация начинается в одной точке молекулы ДНК. В каждой хромосоме высших организмов таких точек обычно бывает по нескольку сот. В точке начала синтеза ДНК могут образоваться одна пли две репликационные вилки. В первом случае репликация протекает в одном направлении; обычно же образуются две вилки, которые движутся по молекуле ДНК в противоположных направлениях. 'Такая двунаправленная репликация показана авторадиографическим методом на кольцевых ДНК бактерий, а также у высших организмов. По мере продвижения репликационных вилок образуются дочерние двуспиральные молекулы ДНК, состоящие наполовину из старых цепей и наполовину из комплементарных им новых цепей ДНК.
Исследование Окадзаки (R. Oka-zaki) биосинтеза ДНК у бактерий показало, что сначала синтезируются сравнительно короткие фрагменты дезоксирибополинуклеотидных цепей длиной до 1000 нуклеотидных остатков, которые затем сшиваются между собой ферментом ДНК-лигазой (полинуклеотидлигазой). Одна из двух цепей ДНК при этом растет непрерывно, а другая прерывисто. Образование фрагментов Окадзаки показано и у высших организмов. Показано, что разъединение и раскручивание двух полинуклеотидных цепей двойной спирали ДНК, необходимое для репликации, осуществляется при помощи особого ДНК-связывающего белка.
Репликация вирусных и нескольких кольцевых молекул ДНК имеет некоторые особенности. Так, одноцепочечная ДНК вируса Ф Х174 сначала синтезирует на своей матрице комплементарную цепь -- так называемый минус-цепь. Эта цепь замыкается в кольцо ДНК-лигазой и образует биологически активную репликативную форму ДНК бактериофага. А. Корнбергом эта последовательность реакций была воспроизведена вне организма, и таким образом впервые была получена синтетическая биологически активная репликативная форма ДНК. У кольцевых молекул ДНК митохондрий обнаружено присутствие небольшого фрагмента длиной около 450 нуклеотидных остатков, комплементарного одной («легкой») цепи двуспиральной молекулы ДНК. Другая («тяжелая») цепь в этом участке смещается и образует так называемую D-петлю. Названный фрагмент служит начальным участком синтезирующейся «тяжелой» цепи ДНК, «легкая» цепь синтезируется на освободившейся «тяжелой» цепи исходной ДНК. Репликация происходит асимметрически в одном направлении и начинается с предобразованных фрагментов. В ДНК паповавирусов, например вируса SV 40 и вируса папилломы, репликация идет сразу в двух направлениях. У бактерий репликация, по всей вероятности, начинается в месте прикрепления ДНК к мембране. У высших организмов ДНК хромосом также связана с внутренней мембраной ядра, однако значение этой связи в процессе репликации пока не ясно.
Помимо репликации ДНК, в организме происходит репарация ДНК, то есть восстановление поврежденных, разрушенных или измененных участков полинуклеотидных цепей. Разрывы в одной из полинуклеотидных цепей ДНК, по-видимому, репарируются под действием ДНК-лигазы. Более сложные повреждения, например образование димеров тимина под действием ультрафиолетовой радиации, ликвидируются следующим образом: поврежденный участок, содержащий димер тимина, «вырезается» при помощи эндонуклеазы (обычно это олигонуклеотид, три-илп тетрануклсотид), а брешь заполняется нормальным нуклеотидным блоком. В процессе репарации участвует ряд ферментов: эндо-, экзо-1 и экзо-11 нуклсазы и ДНК-полимераза. Расшифровка механизмов повреждения и репарации ДНК несомненно приведет к более эффективной профилактике и терапии болезней, вызванных радиационными и химическими мутагенами.
При изучении мутанта Е. coli, чувствительного к ультрафиолетовому облучению, выяснилось, что он дефектен и в отношении ДНК-полимеразы. Однако у этого мутанта (Ро1А~) продолжалась репликация ДНК. На этом основании возникло предположение, что описанная А. Корнбергом полимераза участвует в репарации и не участвует в репликации. Вскоре из мутанта Ро1А" была выделена другая ДНК-полимераза, сходная по механизму действия с ранее известной, но отличная от нее по некоторым свойствам. ДНК-полимеразу II стали считать ответственной за репликацию. Затем была выделена ДНК-полимераза III, по своим свойствам напоминающая ДН1-?-полимеразу I. Таким образом, обнаружено три ДНК-полпмеразы, причем, по-видимому, для репликации необходима именно ДНК-полимераза III.
В онкогенных РНК-содержащих вирусах (онкорнавирусах) обнаружен фермент, катализирующий синтез комплементарной цепи ДНК на матрице, то есть процесс, обратный процессу переноса информации от ДНК к РНК. Этот фермент получил название «РНК-зависимая ДНК-полимераза» или «обратная транскриптаза». Открытие этого фермента означало успех науки о злокачественных опухолях -- онкологии. Ранее было установлено, что при злокачественном перерождении клеток под действием онкогенных вирусов происходит включение ДНК вируса в хромосому клетки хозяина. Однако из этой закономерности выпадали РНК-содержащие онкогенные вирусы. Оказалось, что они содержат обратную транскриптазу, которая сразу после заражения по вирусной РНК синтезировала вирусную ДНК, которая и внедрялась в хромосому клетки хозяина.
Страницы: 1, 2, 3, 4
