Рис.1

Изучение продукции фенилаланина на 2Н2О-содержащих средах.

Во всех экспериментах не зависимо от присутствия 2Н2О в ростовой среде было зафиксировано увеличение продукции фенилаланина на ранней фазе экспоненциального роста, когда выход микробной биомассы был незначителен, в то время как на фазе позднего экспоненциального роста наблюдалось снижение уровня его накопления в ростовой среде (рис. 3). Для того чтобы объяснить эффект снижения уровня накопления фенилаланина были высказаны возможные предположения о морфологической неоднородности микробной популяции, ингибировании биосинтеза фенилаланина конечным продуктом нарушении транспорта фенилаланина через клеточную мембрану. Результаты по микроскопическому исследованию растущей популяции микроорганизмов показали, что данный характер динамики накопления фенилаланина не коррелировал с качественными изменениями клеточной морфологии на поздних стадиях роста, что служило подтверждением морфологической однородности микробной популяции. Скорее всего, накопленный экзогенно в процессе роста фенилаланин ингибировал ферменты собственного пути биосинтеза. Кроме того, не исключена возможность, что при выращивании без рН-статирования может происходить как обратное превращение секретируемого фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза по пути шикимовой кислоты, так и спонтанная ассимиляция фенилаланина клеткой для обеспечения своих собственных метаболических потребностей, что отмечено в других работах [15, 16]. Эффект уменьшения уровня накопления фенилаланина наблюдался при росте как на протонированной, так и на среде с 98 об.% 2Н2О, что затрудняло его исследование (рис. 3). Из-за того, что на среде с 98 об.% 2Н2О ухучшались все ростовые параметры, было сделано предположение, что уменьшение уровня накопления фенилаланина в ростовой среде относится не к изменению транспорта фенилаланина через клеточную мембрану, а к негативному биостатическому эффекту 2Н2О. Данные по исследованию культуральной жидкости методом ТСХ показали, что кроме фенилаланина данный штамм синтезирует и накапливает в ростовой среде незначительные количества (на уровне 5-6 ммоль) метаболически связанных с ним аминокислот (аланин, валин, лейцин/изолейцин), присутствие которых также подтверждалось анализом смеси метиловых эфиров N-DNS-производных аминокислот методом масс-спектрометрии EI MS.

Рис.2.

Изучение уровней включения дейтерия в молекулы аминокислот.

В настоящей работе уровни включения дейтерия в молекулы аминокислот определяли методом масс-спектрометрии EI MS в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот, за счет сопоставления молекулярных масс протонированных и 2Н-меченых производных аминокислот.

Полученные микробиологическим синтезом 2Н-меченые аминокислоты представляли собой смеси изотопнозамещённых форм молекул, различающихся количеством атомов водорода, замещённых на дейтерий. Вследствие этого эффекта пики молекулярных ионов метиловых эфиров N-Dns-аминокислот в масс-спектрах были полиморфно расщеплены на кластеры за счет примеси молекул с отношениями m/z, больше или меньше детектируемых прибором величин (М)+ с различным вкладом в суммарный уровень дейтерированности. В качестве примера на рис. 4, б приведен масс-спектр смеси метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот полученных со среды с 98 об.% 2Н2О (масс-спектр приведен относительно контрольных условий (а) на обычной воде). Подсчет уровня дейтерированности молекул аминокислот проводили по величине самого интенсивного пика молекулярного иона (М)+, зарегистрированного самим масс-спектрометром; для фенилаланина - шесть (М+ при m/z 418 вместо М+ при m/z 412 для протонированного метилового эфира N-Dns-фенилаланина), для аланина -3.1 (М+ при m/z 339.5 вместо М+ при m/z 336.4), для валина -4.7 (М+ при m/z 369.2 вместо М+ при m/z 364.5), для лейцина/изолейцина -5.1 атома дейтерия (М+ при m/z 383.6 вместо М+ при m/z 378.5). Таким образом, общее количество дейтерия в молекуле фенилаланина составило 75%, аланине -77.5%, валине -58.8%, лейцине/изолейцине 51%. Уровни дейтерированности 2Н-меченых аминокислот семейства лейцина должны быть ниже остальных вследствие того что лейцин добавляли в ростовую среду в протонированном виде, что подтвердилось экспериментальными данными (см. выше). В то же время биосинтез фенилаланина был косвенно связан с ауксотрофностью по лейцину, поэтому дейтеривая метка в молекуле самого фенилаланина также была несколько разбавлена.

Полученные данные в целом подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация к 2H2О является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные клетки возвращались к нормальному росту и биосинтезу фенилаланина в протонированных средах после некоторого лаг-периода. В то же время эффект обратимости роста на 2H2O/Н2O- средах теоретически не исключает возможности того, что этот признак стабильно сохраняется при росте в Н2О, но маскируется при переносе клеток на дейтерированную среду. В общих чертах, при переносе клетки в дейтерированную среду она не только постепенно теряет обычную воду за счет насыщения внутриклеточной среды 2H2О, но и происходит очень быстрый изотопный (1Н-2H)-обмен в гидроксильных, карбоксильных, сульфгидрильных и аминогруппах всех биологических макромолекул, включая нуклеиновые кислоты и полипептиды. Затем в процессе роста клетки дейтерий включается в углеродные скелеты макромолекул, образуя связи типа С-2H [17]. В связи с тем, что физико-химические параметры С-2Н связи существенно отличаются от ее протонированного прототипа [18], можно предположить, что клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют стабилизации работы макромолекулярных компонентов жизненно-важных систем, которые подверглись дейтерированию. Не исключено, что положительные эффекты, наблюдаемые при адаптации к 2H2О связаны с образованием в 2H2O конформаций 2Н-меченых макромолекул с иными структурно-динамическими свойствами, чем конформаций, образованных с участием водорода, и поэтому имеющих другую активность и биологические свойства, подходящие для работы в 2Н2О. С другой точки зрения пространственная структура 2Н-меченых макромолекул может стабилизироваться в 2H2О за счет вторичного изотопного эффекта дейтерия и действия 2H2О как растворителя (большая структурированность, плотность и вязкость по сравнению с Н2О) [19].

Суммируя полученные для изученного штамма данные, можно сделать вывод об адаптивной стабилизации посредством постепенного привыкания к 2Н2О и как следствие этого улучшения ростовых и биосинтетических параметров. Выбор метилотрофных бактерий в качестве модельных объектов для данных исследований представляется наиболее целесообразным, так как метилотрофы как организмы, реализующие RuMP и сериновый пути ассимиляции MetOH, эволюционно просты и достаточно лабильны в генетическом аспекте и тем самым быстрее реагируют и приспосабливаются к изменчивым факторам среды. В настоящее время аналогичные подходы по адаптации других штаммов метилотрофных бактерий к 2Н2О активно изучаются.

Страницы: 1, 2