Масс-спектрометрическая оценка уровня включения дейтерия и углерода-13 в молекулы аминокислот бактериальных объектов - рефераты, скачать рефераты, бесплатно рефераты

Рефераты. Масс-спектрометрическая оценка уровня включения дейтерия и углерода-13 в молекулы аминокислот бактериальных объектов

b>Таблица 2

Уровни включения 2Н и 13С в молекулы аминокислот, секретируемых в культуральную жидкость (КЖ) B. methylicum и M. flagellatum, и в аминокислотные остатки белков (данные получены для метиловых эфиров N-Dns-аминокислот и N-Cbz-аминокислот)

Аминокислоты	Содержание 2Н2О в среде, %* 24.5 49.0 73.5 98.0 КЖ белок КЖ белок КЖ белок КЖ белок	1%13СН3ОН** КЖ белок
Глицин	- 15.0	- 35.0	- 50.0	- 90.0	60.0 90.0
Аланин	24.0 20.0	37.5 45.0	62.5 62.5	77.5 97.5	35.0 95.0
Валин	20.0 15.0	46.3 36.3	43.8 50.0	58.8 50.0	50.0 50.0
Лейцин/изолейцин	15.0 10.0	47.0 42.0	46.0 45.0	51.0 49.0	38.0 49.0
Фенилаланин	15.0 24.5	27.5 37.5	51.2 50.0	75.0 95.0	95.0 80.5
Тирозин	- 20.0	- 25.6	- 68.8	- 92.8	- 53.5
Серин	- 15.0	- 36.7	- 47.6	- 86.6	- 73.3
Аспарагиновая кислота	- 20.0	- 36.7	- 60.0	- 66.6	- 33.3
Глутаминовая кислота	- 20.0	- 40.0	- 53.4	- 70,0	- 40.0
Лизин	- 10.0	- 35.3	- 40.0	- 58.9	- 54.4

Из табл. 2 видно, что условиях ауксотрофности по L-лейцину уровни включения 2Н в молекулы лейцина/изолейцина ниже, чем для фенилаланина. Отмеченная особенность отчётливее всего проявляется на среде с максимальной концентрацией 2Н2О. Ещё раз этот результат подтвердили рис. 5, где показан масс-спектр [2Н]аминокислот культуральной жидкости в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот после выращивания бактерий B. methylicum в указанных условиях. Видно, что величина m/z 418.0 пика молекулярного иона метилового эфира N-Dns-фенилаланиа увеличивается по сравнению с контрольными условиями на 6 единиц, что соответствует замещению 75% от общего количества атомов водорода в молекуле. В отличие от фенилаланина уровень включения дейтерия в лейцин/изолейцин составил 51.0%, а в валин - 58.8%. Примечательно, что в масс-спектре этого образца фиксируется пик обогащённого дейтерием бензильного фрагмента при m/z 97.0 (вместо m/z при 91.0 в контроле), что указывает на частичную локализацию атомов дейтерия в молекуле фенилаланина в положениях С2-С6 ароматического кольца и сопредельном с ними положении при углеродном атоме . Несмотря на то, что в остальных опытах пики бензильных фрагментов не были зафиксированы, логично предположить, что при других концентрациях 2Н2О дейтерий также включается в ароматическое кольцо фенилаланина, так как в 2Н2О метаболизм у штамма B. methylicum не претерпевает существенных изменений [25].

Аналогичная закономерность в уровнях включения 13С в молекулы аминокислот, связанных с ауксотрофным метаболизмом, проявляется при выращивании L-изолейцинзависимого штамма M. flagellatum на среде с 1% (13С)метанолом. Как видно из табл. 2, в отличие от наблюдаемого для [13С]фенилаланина (уровень изотопного включения - 95.0%), уровни включения изотопа 13С в молекулы лейцина/изолейцина, аланина и валина составили 38.0; 35.0; 50.0% соответственно. Уровень изотопного включения для [13C]глицина (60%) хотя и выше, чем для трёх последних аминокислот, но намного ниже, чем для фенилаланина.

Суммируя полученные данные по уровням включения 2Н-и 13С в молекулы секретируемых аминокислот, можно сделать вывод о сохранении минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом лейцина и метаболически родственных с ним аминокислот de novo. Другим логическим объяснением наблюдаемого эффекта, если принять во внимание происхождение лейцина и изолейцина по различным путям биосинтеза, может быть ассимиляция клеткой немеченого лейцина из среды на фоне биосинтеза меченого изолейцина de novo. Учитывая данные эффекты следует подчеркнуть, что использование ауксотрофных форм микроорганизмов для получения изотопномеченых аминокислот не оправдывает себя практически из-за множественного включения изотопов в молекулы. Напротив, использование для этих целей прототрофных форм микроорганизмов кажется более перспективным.

Общие принципы изучения уровней изотопного включения в молекулы аминокислот при данном способе введения метки были продемонстрированы на примере анализа сложных мультикомпонентных смесей, полученных после гидролиза суммарных белков биомассы метилотрофных бактерий, а также индивидуального белка - бактериородопсина, выполняющего роль АТФ-зависимой транслоказы в клетках галофильной бактерии Halobacterium halobium. Как видно из рис. 6, до десяти аминокислот могут быть идентифицированы в гидролизате белка B. methylicum по пикам молекулярных ионов метиловых эфиров их N-Dns-производных аминокислот.

Как и в случае с секретируемыми аминокислотами, пики М+. соответствовали смесям изотопнозамещённых форм аминокислот. Для лизина и тирозина пики М+. соответствовали метиловым эфирам ди-производных аминокислот - , -ди-Dns-лизину (с М+. при m/z 631.0) и О, N-ди-Dns-тирозину (с М+. при m/z 663.9). Уровни изотопного включения дейтерия в молекулы аминокислот при содержании 2Н2O в ростовой среде 49% варьируют от 25.6% для тирозина до 45.0% для аланина (рис. 6 б и табл. 2). В молекулах глицина, валина, фенилаланина, серина, лизина, аспарагиновой и глутаминовой кислот они находятся в пределах 35 - 40%. Что касается других аминокислот, не детектируемых данным методом, очевидно, что уровни изотопного включения в них приблизительно такие же. Это подтверждается данными по разделению белковых гидролизатов метилотрофных бактерий методами обращённо-фазовой ВЭЖХ в виде N-Cbz-производных аминокислот или метиловых эфиров их N-Dns-производных аминокислот и ионнообменной хроматографии, где детектируется уже 15 аминокислот (см., например, рис. 7).

Полученные данные свидетельствуют о возможности достижения максимальных уровней включения стабильных изотопов 2Н и 13С в аминокислотные остатки суммарных белков биомассы (за исключением лейцина/изолейцина и валина, сниженные уровни включения для которых объясняются эффектом ауксотрофности по L-лейцину и по L-изолейцину). Например, в случае с дейтерированными аминокислотами полного замещения на стабильные изотопы удалось достичь за счет использования в качестве источника дейтерия 98% 2Н2О (табл. 2). Как видно из табл. 2, при росте B. methylicum на среде с 98% 2Н2О, уровни включения дейтерия в остатки глицина, аланина, фенилаланина и тирозина составляют 90.0; 97.5; 95.0 и 92.8%. В экспериментах по включению изотопа 13С в суммарные белки биомассы за счёт утилизации (13С)метанола метилотрофными бактериями M. flagellatum также наблюдались высокие уровни изотопного включения в глицине (90%), аланине (95.0%) и фенилаланине (80.5%) (табл. 2). Как и в случае с секретируемыми аминокислотами, сниженные уровни включения стабильных изотопов в лейцине/изолейцине (49%), а также в метаболически связанных с ним аминокислотах в этих условиях могут быть объяснены эффектом ауксотрофности штамма по L-изолейцину, который добавляли в ростовую среду в немеченом виде.

Во всех экспериментах по включению стабильных изотопов в молекулы аминокислот уровни включения 2Н и 13С в метаболически связанные аминокислоты обнаружили определённую коррелляцию. Так, уровни изотопного включения для валина и лейцина (семейство пирувата), фенилаланина и тирозина (семейство ароматических аминокислот) коррелируют (см. табл. 2). Уровни изотопного включения для глицина и серина (семейство серина), аспарагиновой кислоты и в лизина (семейство аспарагина) также имеют близкие величины. Из данных табл. 2 видно, что уровни изотопного включения секретируемых аминокислот и соответствующих аминокислотных остатков суммарного белка при выращивании бактерий на средах с одинаковым изотопным насыщением, в целом, также коррелируют. Причина некоторых наблюдаемых расхождений в уровнях включения изотопов в молекулы аминокислот до конца не изучена.

Данный биосинтетический подход показал хорошие результаты по изучению введения дейтериевой метки в молекулу бактериородопсина, выращенного на среде, содержащей L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланин, L-[3,5-2Н]тирозин и L-[2,4,5,6,7-2Н]триптофан (рис. 8). Как видно из рис. 8, в масс-спектре дериватизованного гидролизата бактериородопсина детектируются пики, соответствующие молекулярным ионам обогащённых дейтерием метиловых эфиров N-Dns-фенилаланина с молекулярным ионом при m/z 417 (ср. m/z 412 для немеченого производного фенилаланина), N-Dns-тирозина с М+. при m/z 429 (ср. m/z 428 для производного тирозина) и N-Dns-триптофана с М+. при m/z 456 (ср. m/z 451 для производного триптофана). Все они отвечают смеси изотнопозамещённых форм аминокислот, различающихся количеством атомов водорода, замещённых на дейтерий. Множественный характер включения дейтерия свидетельствует о возможном вкладе биосинтеза de novo в уровни дейтерированности ароматических аминокислот, но также не исключено, что он определяется самим способом получения изотопномеченых молекул. Кроме вышеобозначенных аминокислот в масс-спектре фиксируются пики молекулярных ионов метиловых эфиров -N-Dns-глицина (m/z 322), N-Dns-аланина (m/z 336), N-Dns-валина (m/z 364) и N-Dns-лейцина/изолейцина (m/z 378). Как и следовало ожидать, эти аминокислотные остатки в бактериородопсине не содержат дейтерия.

Таким образом, проведённые исследования продемонстрировали эффективность масс-спектрометрии электронного удара N-Cbz-производных аминокислот и метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот для исследования уровней изотопного обогащения молекул аминокислот в составе их мультикомпонентных смесей, полученных биосинтетически с использованием микроорганизмов. Метод незаменим для изучения состава пула аминокислот, секретируемых в культуральные жидкости штаммов-продуцентов, выращенных на средах со стабильными изотопами.

Страницы: 1, 2, 3, 4