Мембранная энзимология - рефераты, скачать рефераты, бесплатно рефераты

Рефераты. Мембранная энзимология

ельзя, однако, исключить и иное объяснение: давление влияет на фермент прямо, а не опосредованно через липид. Впрочем, эти эксперименты важны уже тем, что показывают возможность изменения физического состояния мембраны под действием гидростатического давления.

4.5 Переносчик глюкозы

Поразителен, однако, тот факт, что на максимальную скорость работы этого переносчика вообще не влияет температурный фазовый переход липида из жидкокристаллического состояния в гель.

5. Мембраносвязанные электротранспортные цепи

В большинстве работ, посвященных мембранным ферментам, исследовались компоненты различных мембранных систем электронного транспорта. Эти системы выполняют весьма важные биохимические функции, а их компоненты содержат окрашенные простетические группы, что позволяет следить с помощью спектрофотометрического метода за кинетикой их редокс- или конформационных превращений как в нативной мембране, так и после выделения и очистки отдельных ферментов. Здесь мы рассмотрим четыре основные злектронтранспортные системы, схематически изображенные на рис. 5. Это:

1) участвующая в биосинтезе стероидов, содержащая цитохром Р450 система митохондрий коры надпочечников;

2) система микросомного окисления, включающая множество цитохромов Р450, а также цитохром bs \ 3) дыхательная цепь митохондрий;

4) фотосинтетическая система тилакоидов зеленых растений. Все четыре системы являются основными белковыми компонентами мембран, в которых они локализованы, и могут служить иллюстрацией различных уровней организации мультиферментных комплексов в мембранной энзимологии. Первые две системы катализируют анаболические и катаболические реакции, протекающие в присутствии молекулярного кислорода и обычно липофильных мембраносвязанных субстратов. Терминальные ферменты этих электронтранспортных цепей, цитохром Р450 и десатураза жирных кислот, характеризуются очень низким числом оборотов. Системы и являются основными электронтранспортными ансамблями энергетического обмена, первичная функция которых состоит в переносе протонов через мембрану. Генерируемый при этом градиент электрохимического потенциала протонов используется для синтеза АТР. В отличие от микросомной и митохондриальной систем цитохрома Р450, дыхательная и фотосинтетическая цепи катализируют трансмембранные реакции и характеризуются довольно высоким числом оборотов, 200-300 с " 1. В приведенном ниже кратком обзоре основное внимание обращается на частные вопросы, интересные с точки зрения энзимологии, отмечаются некоторые общие черты, а также представляющие особый интерес дискуссионные моменты.

При рассмотрении любой из этих систем, естественно, возникает вопрос: до какой степени могут взаимодействовать друг с другом различные мембраносвязанные компоненты этих электронтранспортных цепей, с тем чтобы образовались долгоживущие комплексы? Теоретическое рассмотрение вероятности ассоциации мембранных белков показывает, что наиболее важны следующие факторы:

1) высокая концентрация реакционноспособных белков из-за ограниченности мембранного пространства;

2) заранее заданная ориентация белков, поскольку они могут вращаться лишь в плоскости, параллельной плоскости мембраны; вращение перпендикулярно поверхности бислоя запрещено;

3) исключенный объем, связанный с наличием в мембране других белков, что приводит к еще большему концентрированию компонентов этих систем.

5.1. Система синтеза стероидов в митохондриях

Выделяемые надпочечниками стероидные гормоны, такие, как кортизон, синтезируются из холестерола в ходе реакций, катализируемых ферментами, которые локализованы в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме. При этом промежуточные продукты метаболического пути должны "курсировать" между данными органеллами. Реакции катализируются мембраносвязанными гемсодержащими белками - цитохромами Р450. Название этой большой группы ферментов связано с тем, что максимум их поглощения приходится на длину волны 450 нм. Эти ферменты являются оксидазами со смешанной функцией; в катализируемой ими реакции происходит расщепление молекулы кислорода, при этом один атом кислорода включается в состав молекулы воды, второй - в субстрат. В биосинтезе стероидов участвуют четыре цитохрома Р450. Два находятся в митохондриях, два - в эндоплазматическом ретикулуме ткани. Необходимые для реакции электроны поступают в систему через относительно простую электронтранспортную цепь.

В митохондриях коры надпочечников источником электронов для синтеза гормонов является NADPH, который восстанавливает флавопротеин и ферредоксин. Эти белки локализованы на матриксной стороне внутренней митохондриальной мембраны. Два цитохрома Р450, P450scc и Р450п#, являются интегральными мембранными ферментами, способными взаимодействовать с мембраносвязанными субстратами. Адренодоксин-редуктаза, возможно, частично погружена в бислой, но легко отделяется от мембраны. Адренодоксин - это низкомолекулярный рао" творимый белок, он переносит электроны от флавопротеи" на к цитохромам Р450. Взаимодействие адренодоксина с редуктазой и цитохромами Р450 осуществляется главным образом с помощью ионных взаимодействий. Вероятно, с обоими реакционными партнерами адренодоксин связывается с помощью одного и того же домена. Такой же способ передачи электронов между двумя мембранными ферментами при участии небольшого растворимого белка можно обнаружить и в дыхательной, и в фотосинтетической электронтранспортных системах. Связывание стероидных субстратов с цитохромами Р450 можно зарегистрировать по изменениям в спектре поглощения гема. Холе-стеролсвязывающий центр, по-видимому, экспонирован в гидрофобную область липидного бислоя. Показано также, что связывание холестерола более чем в 10 раз увеличивает сродство адренодоксина к цитохрому Р450.

Число оборотов адренодоксина гораздо выше, чем двух указанных ферментов, поэтому одна молекула восстановленного адренодоксина может обеспечить электронами несколько молекул цитохрома Р450. Указанная на Рис.6.5 стехиометрия компонентов при условии, что лимитирующим является функционирование цитохромов Р450, создает своеобразный эффект электронного каскада. Очевидно, что при таких обстоятельствах три компонента этой простой системы не смогут образовать единый суперкомплекс, да и вряд ли формирование такого комплекса способствовало бы эффективному переносу электронов по цепи.

5.2 Микросомные электронтранспортные цепи

Электронтранспортные цепи, локализованные на цитоплазматической поверхности эндоплазматического ретикулума, участвуют также в метаболических превращениях липофильных субстратов. Как видно из Рис.6.5, существуют две такие системы, но, как недавно выяснилось, они не являются независимыми. В одной системе NADH окисляется флавопротеином цитохром fts-редуктазой, которая в свою очередь через цитохромы восстанавливает стеарил-СоА-десатуразу. В микросомах печени десатураза является индуцибельным ферментом. Вторая система включает в себя окисление NADPH другим флавопротеином, цитохром Р450-редуктаз<цй, которая затем передает электроны на целое семейство цитохромов Р450. Одни из этих цитохромов также являются индуцибельными, другие - конститутивными. Отметим, что в обеих системах число терминальных ферментов значительно превышает число редуктаз в начале каждой цепи. Как и в Р450-содержащей системе митохондрий, число оборотов терминальных ферментов настолько мало, что небольшое число редуктаз вполне успевает обеспечить восстановительными эквивалентами все молекулы терминальных ферментов. Микросомная система не содержит каких-либо растворимых белковых компонентов, аналогичных адренодоксину; все ферменты представляют собой интегральные мембранные белки, их можно выделить из мембраны, очистить и исследовать в реконструированном виде.

В серии обстоятельных работ Штритматтер с коллегами четко показал, что цитохром />5-редуктаза и цитохром bs распределены в мембране случайным образом и взаимодействуют благодаря диффузии: эти два фермента диффундируют латерально по поверхности мембраны, а перенос электронов происходит только во время их случайных столкновений. Такой механизм реализуется как в реконструированных протеолипосомах, так и в микросомной мембране. Диффузия, однако, не является лимитирующим процессом. В норме в системе имеется десятикратный избыток цитохрома bs над редуктазой. Такой избыток связанного с мик-Росомной мембраной экзогенного цитохрома bs кинетически эквивалентен эндогенному пулу цитохромов bs. И цитохром bs, и цитохром 65-редуктаза являются двухдоменными белками, в которых глобулярный растворимый домен связывает простетическую группу, а единственный гидрофобный хвост заякоривает белок в мембране. Гемсвязывающий и флавинсвязывающий домены сконструированы таким образом, чтобы облегчить перенос электрона от флавина к гему при взаимодействии этих белков.

В более поздних исследованиях, однако, были получены серьезные указания на то, что часть цитохрома bs в микросомах не диффундирует свободно, а по крайней мере временно образует стехиометрические комплексы с цитохромами Р450 и, возможно, с NADPH-цитохром Р450-редуктазой. Таким образом, цитохром bs играет важную роль в работе электронтранспортной цепи, включающей по крайней мере некоторые изоформы цитохрома Р450 из микросом печени.

Различные цитохромы Р450 в микросомах печени окисляются целым рядом эндогенных липофильных субстратов, а также чужеродных молекул. Если исходить из первичной структуры изоформ цитохромов Р450, то эти белки должны иметь множество трансмембранных сегментов, однако экспериментальные исследования показывают, что, по-видимому, ферменты заякорены в микросомной мембране с помощью единственного трансмембранного спирального домена, расположенного ближе к N-концу полипептида. NADPH-цитохром Р450-редуктаза имеет близкую структуру с большим гидрофильным доменом, прикрепленным к мембране коротким гидрофобным хвостом. Чтобы объяснить, каким образом одна молекула редуктазы может "обслужить" столь большой избыток молекул Р450, предложено два механизма. В одном постулируется существование стабильного кластера, представляющего собой молекулу редуктазы в окружении молекул цитохромов Р450. Согласно второй модели, для переноса электронов необходимы свободная диффузия и столкновение ферментов. Получены некоторые данные о формировании в реконструированных фосфолипидных протеолипосомах эквимолярных комплексов цитохрома Р450 и его редуктазы. Если такие комплексы действительно существуют в микросомной мембране, то они, по-видимому, представляют собой временные образования, быстро распадающиеся и вновь образующиеся с участием других молекул Р450. Лишь в таком варианте единственная молекула редуктазы может восстановить много молекул цитохромов. Окончательную картину еще предстоит выяснить, но уже ясно, что компоненты микросомной цепи нельзя считать изолированными. Для успешного функционирования системы, вероятно, существенными могут оказаться какие-то сложные варианты белок-белковых взаимодействий.

5.3 Дыхательная система митохондрий

Внутренняя мембрана митохондрий является местом, где осуществляется окислительное фосфорилирование. Суть процесса состоит в сопряжении потока электронов, направленного от органических субстратов к кислороду, с перемещением протонов из матрикса митохондрий через мембрану в межмембранное пространство. Как и предыдущие две электронтранспортные цепи, компоненты этой системы тоже представлены не в эквимолярных количествах, т.е. дыхательная цепь не может функционировать как долгоживущий мультиферментный комплекс. Однако в данном случае число оборотов терминального фермента, цитохром с-оксидазы, весьма велико, а оценить, какая стадия является лимитирующей, в такой ситуации очень непросто. Цепь состоит из четырех трансмембранных мультисубъединичных комплексов, растворимого цитохрома с и убихинона-10. Перенос электронов через комплекс II не сопровождается переносом протонов. Однако реакции, катализируемые комплексом I, комплексом III и комплексом IV, сопровождаются векторным переносом протонов через мембрану. Эти реакции являются электрогенными и приводят к генерации трансмембранного электрического потенциала. Такие ферменты в составе цепи называются "местами сопряжения". Относительно механизмов перемещения протонов пока нет единого мнения, хотя в литературе обсуждаются конкретные модели, в частности для комплексов III и IV. Образующаяся трансмембранная разность электрохимических потенциалов протонов уменьшается за счет работы протонного канала АТР-синтазы. Энергия потока используется этим ферментом для синтеза АТР.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7