2. Попробуйте разный ПЭГ:

а) поменяйте партию ПЭГ. В наших экспериментах та партия ПЭГ, которая давала хорошие результаты при слиянии одного типа клеток, эффективно работала и с другими. Хорошо зарекомендовавший себя препарат необходимо отделить и аккуратно хранить. По некоторым данным свойства ПЭГ могут быть улучшены использованием растворов, не содержащих солей кальция;

б) варьируйте молекулярный вес. Как правило, повышение молекулярного веса влечет за собой увеличение способности индуцировать слияние. Однако раствор ПЭГ с большим молекулярным весом обладает большей вязкостью, что затрудняет отмывку клеток. Так как ПЭГ является

Для каждой конкретной клеточной линии необходимо подобрать оптимальную концентрацию колцемида и время экспозиции. Образование мини-клеток легко контролируется под фазово-контрастным микроскопом. В удачных экспериментах около 50% всех клеток образуют мини-клетки. Эта частота увеличивается после обработки цитохала-зином В.

Второй день

3. Спустя 16 ч замените среду на среду, содержащую цитоха-лазин В в концентрации 2 мкг/мл; инкубируйте в течение ночи.

4. Исходные градиентные растворы поместите в сосуды с неплотно завинченными крышками и инкубируйте в атмосфере 5% СОг при 37 °С в течение ночи.

5. Заранее нагрейте ротор SW41.

Третий день

6. Приготовление ступенчатого градиента фиколла. Тщательно промойте необходимое количество центрифужных пробирок для ротора SW41 абсолютным спиртом, высушите в перевернутом положении в ламинарном боксе. Приготовьте градиент фиколла, используя уравновешенные исходные растворы.

7. Соберите обработанные колцемидом и цитохалазином клетки и осадите их центрифугированием. Ресуспендируйте в 3 мл 10%-ного фиколла и мягко наслоите на градиент. Заполните центрифужные пробирки раствором без фиколла.

8. Поместите пробирки, содержащие градиент, в нагретый ротор SW41 и поставьте ротор в заранее нагретую до 37 °С ультрацентрифугу.

9. Центрифугируйте 1 ч при 25000 об/мин при 37 °С; используйте минимальное ускорение при разгоне и минимальное торможение, чтобы предотвратить разрушение градиента.

10. Выньте пробирки из центрифуги. Мини-клетки образуют рыхлые полоски в градиенте между 15:16% и 16:17% фиколлом. Осторожно отберите эти полоски, используя стерильную пастеровскую пипетку, вводя ее через верх градиента; поместите мини-клетки в новую, стерильную центрифужную пробирку от ротора SW41 и заполните ее средой для роста клеток. Загрязнение фрагментами цитоплазмы, ядрами и целыми клетками можно контролировать под фазово-контрастным микроскопом.

11. Центрифугируйте при 20 000 об/мин при комнатной температуре в роторе SW41 10 мин при максимальном ускорении и торможении. Эта процедура осаждает мини-клетки и отделяет их от фиколла.

12. Для дальнейшей очистки мини-клеток мы предлагаем три различных приема. Очистка не нужна, лишь когда в распоряжении исследователей имеется четкая система селекции. В этом случае они могут сразу использовать мини-клетки для слияния с клетками-реципиентами.

13. Слияние мини-клеток с целыми клетками. Соберите клетки-реципиенты и отмойте их бессывороточной средой. Добавьте приблизительно 107 клеток-реципиентов к осадку мини-клеток в 2 мл бессывороточной ростовой среды, содержащей 100 мкг/мл фитогемагглютинина. Поместите в пластиковый сосуд с коническим дном и инкубируйте 10 мин при 37 °С.

14. Осадите центрифугированием.

15. Процедуру слияния мини-клеток с целыми клетками проводите с помощью ПЭГ, как указано в соответствующей методике.

3. Перенос генов, опосредованный хромосомами JCMGTJ

3.1 Введение

Метод CMGT может быть использован для переноса фрагментов хромосом из ядер клеток одного типа в ядра клеток другого типа. Теоретически клетки любого типа могут быть использованы как в качестве доноров, так и в качестве реципиентов хромосом. Однако на практике возможность применения метода определяется наличием подходящих реципиентных линий, обладающих повышенной способностью акцептировать чужеродную ДНК.

Высокая частота трансфекции может быть достигнута при использовании в качестве реципиентов иммортализованных мышиных клеток. Клеткам хомячка и иммортализованным человеческим клеткам обычно присуща более низкая частота трансфекции. Правда, недавно полученные результаты свидетельствуют о том, что человеческие клетки линии EJ способны трансфицироваться с высокой частотой. В роли донора с одинаковым успехом могут выступать самые разнообразные клеточные линии - как суспензионные, так и субстрат-зависимые. Предпочтительнее использовать в качестве донорных те линии, клетки которых легче культивировать и получать в больших количествах. Ниже описываются общие процедуры, обеспечивающие выделение донорных хромосом и перенос фрагментов этих хромосом в реципиентные клетки путем CMGT.

3.2 Выделение хромосом

В ходе описываемых процедур для предотвращения потерь и поломок хромосом, для обеспечения температурного режима необходимо использовать пластиковые пипетки и пробирки. Клетки блокируют на стадии митоза, митотические хромосомы высвобождают воздействием гипотонического шока и гомогенизацией. Хромосомы очищают дифференциальным центрифугированием.

Таблица. Исходные растворы на CMGT

3.3 Перенос хромосом

Процесс переноса хромосом в этом случае очень напоминает описываемый в методе DMGT. Хромосомы осаждают на поверхности клеток хлоридом кальция, и спустя несколько часов клетки обрабатывают реагентом, способным перфорировать мембраны. Здесь тоже важно использовать пластиковые пробирки и пипетки. Последовательность действий, которая приведена ниже, разработана Нельсоном.

1. За день перед проведением трансфекции высейте по 5Х Х105 клеток на 10 чашек диаметром 9 см. Используйте низкофосфатную среду, например DMEM.

2. Ресуспендируйте 108 хромосом в 9 мл раствора для трансфекции.

3. Медленно добавьте к хромосомам 1 мл 1,25 М раствора СаС12, одновременно продувая воздух через суспензию хромосом.

4. Инкубируйте 20-30 мин при комнатной температуре для: образования смеси фосфат кальция - ДНК.

5. Добавьте по 1 мл этой смеси к среде в каждую чашку с реципиентными клетками. Инкубируйте клетки с хромосомами 4-6 ч в увлажняющем инкубаторе при 37 °С.

6. Удалите среду и добавьте 10 мл отмывочного раствора.

7. Удалите отмывочный раствор и обработайте клетки 1 мл среды для глицеринового шока в течение 4 мин при комнатной температуре.

8. Отмойте клетки 3 раза промывочным раствором и инкубируйте в течение ночи в неселективной среде для роста клеток.

9. Через 24 ч поменяйте среду на селективную. Меняйте среду на свежую каждые 3-4 дня.

10. Колонии появятся на 14-21-й день.

3.4 Предварительная селекция

При использовании DMGT донорная геномная ДНК обычно переносится вместе с плазмидой, кодирующей доминантный селективный маркер. Предварительная селекция, выявляющая включение плазмидной ДНК, позволяет получить 100-кратное обогащение клетками, содержащими интересующий нас клеточный ген. Аналогичный прием может быть использован и в CMGT. Для проведения котрансфекции необходимое количество плазмидной ДНК добавляют к суспензии хромосом перед преципитацией хлоридом кальция. Обычно мы добавляем плазмидную ДНК в количестве, достаточном для достижения соотношения 20:1. Селекцию проводим спутся 24 ч после хромосомной трансфекции.

3.5 Возможные ошибки и варианты методики

В литературе описано множество методов выделения хромосом из клеток, блокированных в метафазе. Процедуры очистки тоже разнообразны. Одни из них позволяют получить высокоочищенные препараты, другие-грубую фракцию хромосом, загрязненную разными компонентами клетки. Мы предпочитаем использовать для проведения трансфекции именно такие грубые препараты, во-первых, потому что их получение занимает мало времени, а во-вторых, потому что хромосомы при этом оказываются наименее разрушенными.

Анализ, проведенный Льюисом, показал, что существует линейная зависимость частоты CMGT-трансфекции от дозы донорных хромосом. В большинстве последующих экспериментов исследователи старались ввести в клетку как можно больше хромосом. Однако на практике количество хромосом, которое можно получить, ограничено. Основное препятствие в использовании очень большого количества донорных клеток - это высокая вязкость суспензии хромосом, которая способствует их агглютинации. Вот почему мы добавляем не более 20 хромосом на одну реципиентную клетку. Помимо механического воздействия для получения препарата хромосом можно применять и химическую обработку, включая использование мягких детергентов, таких, как дигитонин.

Исходя из нашего опыта, можно заключить, что результаты трансфекции воспроизводимы. В некоторых случаях может оказаться необходимым оптимизировать условия «шока», варьируя концентрацию глицерина и время инкубации. Обсуждение способа трансфекции с помощью осаждения фосфатом кальций приводится в разд. 6.

При использовании метода CM.GT образуются реципиентные клетки, содержащие фрагменты донорных хромосом: в некоторых случаях они встраиваются в геном реципиента, иногда реплицируются самостоятельно. Невозможно выделить параметр, контролирующий размеры передаваемого фрагмента, и в большинстве экспериментов получаются клоны, содержащие донорный материал в широком диапазоне. Мы детально анализировали введенные фрагменты во всех случаях. В них наблюдались перестройки: это либо внутренние делеции, либо переобогащение альфоидными последовательностями из области центромеры. Внутренние делеции описаны также другими авторами.

4. Перенос генов, опосредованный ДНК

4.1 Введение

В настоящее время разработано большое количество методов для введения клонированных последовательностей ДНК в клетки млекопитающих. Среди них преципитация фосфатом кальция или DEAE-декстраном, электропробой, использование инактивированных вирусов и слияние прокариотических и дрожжевых протопластов с клетками млекопитающих. Наиболее широкое распространение получила преципитация фосфатом кальция. Точный механизм захвата ДНК, ее включения в реципиентную клетку непонятен, однако известно, что лишь небольшое количество клеток в культуре реципиентов включают ДНК. По аналогии с бактериальной генетикой эти клетки получили название «компетентных». Количество включаемой ДНК - важнейшая характеристика используемой клеточной линии. Мышиные L-клетки включают несколько миллионов пар оснований экзогенной ДНК, человеческие фибробласты - только часть этого количества. Было проведено несколько экспериментов по выявлению максимальных размеров ДНК, передаваемой неповрежденной. Обычно не удается перенести интактную ДНК, размеры которой превышают 100 т. п. н. Неизвестно, зависит ли это от свойств клеток-реципиентов или определяется трудностями в получении таких больших фрагментов ДНК интактными. Недавние успехи в получении высокомолекулярных фрагментов ДНК позволяют проанализировать оба этих варианта.

4.2 Трансфекция ДНК с использованием фосфата кальция

Таблица. Растворы для DMGT

4.3 Совместный перенос и предварительная селекция

Известно, что компетентные клетки способны включать большое количество донорной ДНК, причем одна реципиентная клетка может включать несколько разных молекул донорной ДНК в один геномный сайт. Этот феномен позволяет выделять компетентные субпопуляции из общей массы реципиентных клеток и маркировать геном млекопитающих. Если донорная ДНК смешана с плазмидной, кодирующей селективный для клеток млекопитающих маркер, селекция по плазмидному гену после трансфекции позволяет выделить популяцию трансфицированных клеток. Такое обогащение облегчает дальнейшую очистку реципиентных клеток. Этот прием оказался успешным при клонировании генов, кодирующих клеточные поверхностные антигены. В данном случае для обогащения использовали антитела, а для разделения субпопуляций клеток флуоресцентный сортер.

В реципиентных клетках ДНК плазмиды, содержащей селективный маркер, лигируется с донорной геномной ДНК. Это приводит к «маркированию» последовательности ДНК клетки млекопитающего и может упростить выделение донорного гена после нескольких повторных трансфекции.

В опытах по котрансфекции мы использовали смесь из 1 мкг плазмидной и 20 мкг геномной ДНК. Смесь готовили непосредственно перед добавлением хлорида кальция.

4.4 Возможные ошибки и варианты методики

Не все клетки способны к трансфекции геномной ДНК с высокой частотой. Одни клетки вообще не трансфицируются, другие, например человеческие фибробласты, способны эффективно включать плазмидную ДНК и почти не включать геномную ДНК - Мышиные L-клетки обладают способностью к трансфекции геномной ДНК с высокой частотой и могут быть использованы в качестве положительного контроля в экспериментах по трансфекции ДНК новыми клеточными линиями. Возможно, что альтернативные способы прямого включения геномной ДНК, такие, как электропробой или липосомный перенос, смогут расширить список клеточных линий, способных к трансфекции. В противовес общепринятому мнению мы получали хорошие результаты по трансфекции L-клеток, используя преципитацию, при которой образовывался осадок как в виде слабо опалесцирующей суспензии, так и в форме агрегатов. Тем не менее, конечно, предпочтительнее соблюдать условия, при которых формируется гомогенный осадок.

Глицериновый шок увеличивает частоту трансфекции в 2- 5 раз. Оптимальные условия проведения шока для разных клеток варьируют. В каждом новом случае необходимо подбирать как концентрацию глицерина, так и время инкубации.

Страницы: 1, 2