Схема получения трансгенных животных с использованием стабильно трансформированных клеток.

1.4 Липосомы как переносчики ДНК

Векторами для переноса генных конструкций в эмбриональные линии млекопитающих могут служить липосомы [Rottmann et al, 1985], однако опосредованный ими перенос генов не получили широкого распространения

1.5 Использование половых клеток семенников (спермии и сперматогонии)

Сперматозоиды являются природным вектором, доставляющим ДНК в клетку. Использование спермиев в качестве переносчиков одной ДНК рассматривается как один из перспективных методов генетической модификации животных. В опытах Lavitrano (1989) 30% мышей полученных после оплодотворения обработанной ДНК спермой, оказались трансгенными и передавали трансген по наследству.

Многочисленные попытки в других лабораториях неуспешными. Анализ 1300 мышей, родившихся in vitro обработанной ДНК спермой, не выявил трансген ни у одной из исследованных особей [Brinster, 1989), Недавнее исследования показали, что при применении метода переноса ДНК посредством сперматазоидов в одной и той же лаборатории дае пра использовании одинаковой схемы исследований могут быть получены противоречивые результаты [Maiore et al, 1998]. Это позволяет предположить, что встраивание ДНК происходит только на определенной стадии клеточного цикла. Однако до настоящего времени не установлен механизм интеграции экзогенной ДНК в геном сперматозоидов.

Huguet и Esponda [1998] исследовали способность сперматозоидов поглощать линейную ДНК in vitro и in vivo. В опытах in vitro отмытые придатковые сперматозоиды инкубировали 2 часа с линейной ДНК. ДНК инъецировали в проксимальную область семенных канальцев, после чего через 6 часов извлекали сперматозоиды. Присутствие чужеродной ДНК было показано у 60-70% сперматозоидов. Сперматозоиды способны поглощать ДНК, аккумулировать ее в ядре. Секркты придатков и семенных канальцев не блокируют этот процесс.

Для повышения эффективности связывания ДНК со сперматозоидами используют различные методы: ДНК-липосомные комплексы [Bachiller et al.. 1991], инъекцию в семенники [Sato et al.. 1994], непосредственную инъекцию в семенные канальцы [Kim et al.. 1997] и придатки [Huguet и Esponda, 1998], инъекцию в семенные канальцы с последующей электропорацией [Yamazaki et al.. 1998], ко-инъекцию головок спермиев и ДНК в ооциты [Perry et al. 1999]. Также было показано, что экзогенная ДНК может быть эффективно доставлена в ооциты микроинъецированными сперматозоидами.

Большое внимание в последнее время привлекают манипуляции со стволовыми клетками семенников-сперматогониями [Brinster, Nagano. 1998]. Была продемонстрирована возможность переноса сперматогониев от одного самца другому как у животных одного вида (Avarbock, 1994; Brinster и Zimmermann. 1994), так и между двумя видами.

После пересадки половых клеток из семенников самца мыши в семенники другого самца, до 80% потомства происходило из сперматозоидов самца-донора. Была доказана возможность успешного протекания сперматогенеза после пересадки криоконсервированных клеток семенника и после их длительного консервирования.пересадке в семенники мышей клеток из семенников поздних стадий сперматогенеза половых клеток доноров выявлено не было /Dobnnski et al., 1999].

Успешное длительное культивирование половых клеток животных in uru делает возможным проведение трансформации сперматогониев экзогенной ДНК с последующей селекцией. Nagano с соавторами /2000] сообщили об успешном введении экзогенной ДНК в сперматогонии т vitro и in vivo посредством ретровирусной системы доставки. Экспрессия ретровирусной генной конструкции, включающей lacZ, наблюдалась в семенниках более 6 месяцев. Анализ показал, что по крайней мере 1 из 300 стволовых клеток семенников содержали трансген.

В сочетании с пересадкой трансформированных половых клеток в семенники реципиентов и успешным протеканием сперматогенеза подход может быть использован для получения трансгенного потомства.

Не смотря на хорошие результаты в использовании сперматозоидов для получения трансгенных мышей, а так же отдельные успешные попытки получения трансгенных свиней и КРС [Gandolfl et al, 1989, Schelander et al, 1995, Sperandio et al, 1996], каких-либо значительных успехов в получении трансгенных сельскохозяйственных животных с помощью трансформированных сперматогониев и спермиев до настоящего времени достигнуто не было. Достижения в использовании трансгенных технологий.

2. ФАКТОРЫ ПОВЫШЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ТРАНСГЕНОВ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ

Наряду с низкой эффективностью большинства методов трансгенеза основным лимитирующим фактором получения трансгенных является случайный характер интеграции трансгена в геном. На экспрессию трансгена в организме животных оказывают влияние последовательности, прилегающие кв участку интеграции, что является причиной большой вариабельности уровня экспрессии. Уровень синтеза трангенного продукта может варьировать у различных животных от эктопного до слабого или даже находится ниже порога детекции.

Влияние участка интеграции на уровень и характер экспрессии объясняется так называемым позиционным эффектом [Wilson era/., 1990, Sippel et al., 1997). Кроме того, ограниченные знания регуляторных последовательностей большинства генов приводят к использованию зачастую полностью не охарактеризованных геномных фрагментов, что и является причиной низкой эффективности экспрессии в экспериментах по переносу генов [Palmlter, Brinster, 1986].

Для того чтобы преодолеть позиционный эффект и таким образом увеличить вероятность оптимальной экспрессии трансгенов, интегированных в случайной локализации, был применен целый ряд различных стратегий.

Страницы: 1, 2, 3, 4