Подальші дослідження були направлені на пошук інших компонентів белоксинтезирующей системи.
Білоксинтезуюча система включає: набір всіх 20 амінокислот, що входять до складу білкових молекул; мінімум 20 різних тРНК, що володіють специфічністю до певного ферменту і амінокислоти; набір мінімум 20 різних ферментів - аміноацил-тРНК-синтетаз, що також володіють подвійною специфічністю до якої-небудь певної амінокислоти і одній тРНК; рибосоми (точніше за полісому: що складаються з 4-12 монорибосом з приєднаною до них матричною мРНК); АТФ і АТФ-ГЕНЕРІРУЮЩУЮ систему ферментів; ГТФ, що бере специфічну участь в ініціації і елонгації синтезу білка в рибосомах; іони Mg2+ в концентрації 0,005-0,008 М; мРНК як головний компонент системи, що несе інформацію про структуру білка, що синтезується в рибосомі; нарешті, білкові чинники, що беруть участь в синтезі на різному рівні трансляції.
Розглянемо детальніше структуру і функцію головних компонентів белоксинтезирующей системи.
Рибосоми
Живі організми, як відомо, залежно від структури кліток діляться на дві групи: прокариоты і эукариоты. Перші не містять обмеженого мембраною ядра і мітохондрій або хлоропластів; вони представлені головним чином мікроорганізмами. Клітки еукаріот тварин і рослин, включаючи гриби, навпаки, містять ядра з мембранами, а також мітохондрії (і у ряді випадків хлоропласти).
Обидва типи кліток містять рибосомы, причому рибосомы эукариот (клітки тварин) приблизно в два рази більше рибосом прокариот (бактерії). Зазвичай рибосоми характеризують за швидкістю їх седиментації у центрифужному полі, яка кількісно виражається константою седиментації s, що виражається в одиницях Сведберга S.
Величина s залежить не тільки від розміру частинок, але і від форми і щільності, так що вона не пропорційна розміру. Число рибосом в мікробній клітці приблизно рівне 104, а эукариот -- близько 105.
Хімічно рибосоми є нуклеопротеїнами, що складаються тільки з РНК і білка, причому 80S рибосоми еукаріот містять приблизно рівну їх кількість, а у 70S рибосом прокаріот співвідношення РНК і білка складає 2:1. РНК рибосом прийнято називати рибосомним і позначати рРНК. Як 80S, так і 70S рибосоми складаються з двох субчастинок; це можна за допомогою електронної мікроскопії або шляхом обробки рибосом розчинами, що містять низькі концентрації іонів Mg2+. За цих умов рибосомы дисоціюють на субчастинки; останні можуть бути відокремлені один від одного методом ультрацентрофугування. Одна з субчастинок по розмірах в 2 рази перевищує розмір другої; так, у 70S рибосом величини S для субчастинок рівні 50S і 30S, у 80S рибосом, відповідно 60S і 40S. Субчастинки рибосом кліток еукаріот влаштовані складніше: більше 70 різних білків в обох субчастинках, при цьому велика субчастинка містить 28S, 5,8S і 5S рРНК, а мала містить 18S рРНК (До теперішнього часу повністю розшифрована первинна структура всіх рРНК в 70S і 80S рибосомах і амінокислотній послідовності всіх 55 білків 70S рибосом і частково білків 80S рибосом.).
Для з'ясування тонких молекулярних механізмів синтезу білка в рибосомах необхідні відомості про структуру і функції рибосом. Останнім часом отримані дані, що свідчать про вірогідну просторову тривимірну структуру як цілих рибосом, так і їх субчастинок. Зокрема, з'ясовано, що форму і розміри 30S і 40S рибосом зумовлюють не білкові молекули цих частинок, а третинна структура що входять в їх склад 16S і 18S рРНК. Більш того, за даними акад. А.С. Спірина, для збереження просторової морфологічної моделі всієї 30S субчастинки виявилася достатньою наявність тільки двох білків, що містяться в певних топографічних ділянках молекули 16S рРНК.
Щодо походження рибосом відомо, що рРНК походить із загального попередника всіх клітинних РНК, що у свою чергу синтезується на матриці ДНК в ядрі; рибосомні білки мають походження цитоплазми, потім вони транспортуються в ядерця, де і відбувається спонтанне утворення рибосомних субчастинок шляхом об'єднання білків з відповідними рРНК. Об'єднані субчастинки разом або нарізно транспортуються через пори ядерної мембрани назад в цитоплазму, де ряд рибосом разом з мРНК утворюють полісоми або полірибосоми.
Аміноацил-тРНК-синтетази
Експериментально доведено існування в будь-яких клітках живого організму специфічних ферментів, що каталізують активування амінокислот і скріплення останніх з певними тРНК. Всі ці ферменти виділені в чистому вигляді з E. coli.
Молекулярна маса майже всіх синтетаз рівна 100 000 Так, за винятком фенілаланін-тРНК-синтетази (180 000 Так). Всі вони виявилися чутливими до реагентів на SH-группы і вимагають присутності іонів Mg2+. Ферменти володіють абсолютною специфічністю дії, оскільки вони дізнаються тільки одну яку-небудь L-амінокислоту або одну тРНК; ця обставина надзвичайна важливо, оскільки надалі в білковому синтезі "пізнавання" аміноацил-тРНК засноване не на природі амінокислоти, а на хімічній природі антикодону тРНК. Вважається, що в молекулі кожної аміноацил-тРНК-синтетази є принаймні три центри скріплення: для амінокислоти, тРНК і АТФ; ферменти вельми чутливі також до аналогів амінокислот, які інгібірують активування відповідних амінокислот. Деякі ферменти складаються з одного поліпептидного ланцюга, інші з двох або чотирьох гомологічних або гетерогенних субодиниць.
Аміноацил-трнк-синтетази в активному центрі містять гістидин, імідазольне кільце якого бере участь в скріпленні АТФ за допомогою іонів Mg2+. Найбільшою спорідненістю ці ферменти, як було вказано, володіють по відношенню до молекул специфічних тРНК, хоча конкретний механізм, за допомогою якого ферменти дізнаються відповідну РНК, поки не ясний. В той же час ці ферменти відрізняються низькою молярною активністю (число оборотів не перевищує декількох сотень каталітичних актів в хвилину).
Транспортні РНК
У лабораторії М. Хогланда було з'ясоване, що при інкубації 14С-аминокислоты з розчинної з розчинною фракцією цитоплазми в присутності АТФ і подальшим додаванням трихлороцетової кислоти в білковому осаді, що утворився, мітка не відкривається. Було зроблено висновок, що мічена амінокислота не включається в білкову молекулу. Мітка виявилася пов'язаною ковалентний з РНК, такою, що міститься в безбілковому фільтраті. Показано, що РНК, до якої приєднується мічена амінокислота, має невелику молекулярну масу і зосереджена в розчинній фракції, тому її спочатку назвали розчинною, а потім адапторною або транспортною РНК (тРНК). Трнк припадає на частку приблизно 10 -- 15 % загальної кількості клітинної РНК. До теперішнього часу відкрито більше 60 різних тРНК. Для кожної амінокислоти в клітці є принаймні одна специфічна РНК (для ряду амінокислот відкрито більш за одну, зокрема, для серину -- 5 різних тРНК, для лізину і гліцину -- по 4 різних тРНК, хоча і в цьому випадку кожна тРНК пов'язана із специфічною аміноацил-тРНК-синтетазою). Молекулярна маса більшості тРНК коливається від 24 000 до 29 000 Так. Вони містять від 75 до 85 нуклеотидов. Амінокислоти приєднуються до вільної 3'-OH-групі кінцевого мононуклеотіду, представленого у всіх тРНК АМФ, шляхом утворення ефірного зв'язку. Цікаво, сто всі тРНК володіють не тільки дивно схожими функціями, але і дуже схожою тривимірною структурою.
Встановлена первинна структура майже всіх 60 відкритих тРНК; знання послідовності, а отже, складу тРНК дало в руки дослідників багато цінних відомостей про біологічну роль окремих компонентів тРНК. Загальною для тРНК виявилася також нативна конформація, встановлена методом рентгеноструктурного аналізу і названа спочатку конформацією конюшинового листа; насправді ця конформація має неправильну, Г-подібну форму.
Визначення структури тРНК дозволило виявити ряд відмітних ділянок; так, на 3'-гидроксильном кінці розташовується однакова для всіх тРНК послідовність триплета ЦЦА-ОН, до якої приєднується за допомогою ефірного зв'язку специфічна амінокислота. Скріплення в основному відбувається через 3'-ОН- групу кінцевого аденілового нуклеотиду, хоча отримані докази можливості приєднання амінокислоти через 2'-ОН- групу. Тимін-псевдоуридін-цитиділова (Т(Ц) петливши, мабуть, зв'язує аміноацил-тРНК з поверхнею рибосоми. Є, крім того, додаткова петля, склад якої варіюється у різних типів молекул тРНК; її призначення невідоме. Дигідроуріділова петливши, з іншого боку, виявилася необхідною як сайт (місце) для пізнавання специфічним ферментом -- аміноацил-тРНК-синтетазой. Є також антикодонова петливши, що несе триплет, названий антикодоном, і розташована на протилежній стороні від того кінця, куди приєднується амінокислота. Антикодон є специфічним і комплементарним до відповідного кодону мРНК, причому обидва вони є антипаралельними в своїй комплементарності.
Ретельний аналіз нуклеотидных послідовностей різних тРНК показав, що всі вони містять однаковий 5'-кінцевий нуклеотід -- ГМФ з вільною 5'-фосфатной групою. Адапторна функція молекул тРНК полягає в пов'язанні кожної молекули тРНК зі своєю амінокислотою. Але оскільки між нуклеїновою кислотою і специфічною функціональною групою амінокислоти не існує відповідності і спорідненості, цю функцію пізнавання повинна виконувати білкова молекула, яка дізнається як молекулу специфічної тРНК, так і специфічної амінокислоти.
Природа генетичної коди
Генетична інформація, закодована в первинній структурі ДНК, переводиться ще в ядрі в нуклеотидную послідовність мРНК. Проте питання про те, яким чином ця інформація передається на білкову молекулу, довго не був з'ясований. Перші вказівки на існування прямої функціональної залежності між структурою гена і його продуктом -- білком можна знайти у Ч. Яновського, який в серії витончених дослідів із застосуванням методів генетичного картирування і сективірування показав, що порядок змін в структурі гена мутанта триптофанситази у E. coli в точності відповідає порядку відповідних змін в амінокислотній послідовності молекули білка-ферменту.
Раніше було відомо, що молекули мРНК не володіють спорідненістю до амінокислот, тому для перекладу нуклеотидної послідовності мРНК на амінокислотну послідовність білків потрібний якийсь посередник, названий адаптором. Молекула адаптора повинна бути у свою чергу наділена здатністю дізнаватися нуклеотидну послідовність специфічної мРНК і відповідну амінокислоту. Володіючи подібною адапторною молекулою клітка може включати кожну амінокислоту у відповідне місце поліпептидного ланцюга, в строгій відповідності з нуклеотидною послідовністю мРНК. Залишається, таким чином, непорушним положення, що самі по собі функціональні групи амінокислот не володіють здатністю вступати в контакт з матрицею інформаційної мРНК.
Було показано, що в нуклеотидной послідовності молекули мРНК є кодові слова для кожної амінокислоти -- генетичний код. Проблема, проте, зводиться до того, з чого складається цей таємничий код? Найімовірніше, він полягає в певній послідовності розташування нуклеотидів в молекулі ДНК . Питання про те, які нуклеотиди відповідальні за включення певної амінокислоти в білкову молекулу і яку кількість нуклеотидів визначає це включення, залишався невирішеним до 1961 р. Теоретичний розбір показав, що код не може складатися з одного нуклеотиду, оскільки в цьому випадку тільки 4 амінокислоти можуть кодуватися. Але код не може бути і дуплетним, тобто комбінація з двох нуклеотидів з чотирьохбуквеного алфавіту не може охоплювати всіх амінокислот, оскільки подібних комбінацій теоретично можливо тільки 16 (42=16), а до складу білка входять 20 амінокислот. Для всіх амінокислот білкової молекули було б досить узяти триплетний код, коли число можливих комбінацій складе 64 (43=64).
З приведених вище за дані М. Ніренберга стає очевидним, що Полі-у, тобто РНК, що гіпотетично вміщує залишки тільки одного уриділового нуклеотиду, сприяє синтезу білка, побудованого із залишків однієї амінокислоти -- фенілаланину. На цій підставі був зроблений вивід, що кодоном для включення фенілаланину в білкову молекулу може служити триплет, що складається з 3 уриділових нуклеотидів, -- УУУ. Незабаром було показано, що синтетична матрична поліцитиділова кислота (поли - Ц) кодує утворення поліпролину, а матрична поліаденілова кислота (поли-А) -- полілізина. Відповідні триплети -- ЦЦЦ і ААА -- дійсно виявилися триплетами (названими кодонами) для кодування проліну лізину.
М. Ніренберг, С. Очоа и Х. Корану, користуючись штучно синтезованими мРНК, представили докази не тільки складу, але і послідовності триплетів всіх кодонів, відповідальних за включення кожній з 20 амінокислот білкової молекули.
Генетичний код для амінокислот є виродженим. Це означає, що переважне число амінокислот кодується з декількома кодонами, за винятком метіоніну і триптофану, решта амінокислот має більш за один специфічний кодон. Виродженність коди виявляється неоднаковою для різних амінокислот. Так, якщо для серину, аргініну і лейцину є по 6 кодових слів, то ряд інших амінокислот, зокрема глутамінова кислота, гістидин і Тирозин, мають по два кодони, а триптофан -- тільки 1. Слід зазначити, що виродженність найчастіше стосується тільки третього нуклеотиду, тоді як для багатьох амінокислот перші два нуклеотиди є загальними. Цілком допустимо тому припущення, що послідовність перших два нуклеотидов визначає в основному специфічність кожного кодону, тоді як третій нуклеотид менш существен. Останнім часом з'явилися докази гіпотези два з трьох, що означає, що код білкового синтезу, можливо, є квазі- або псевдодуплетним. Є докази, що вырожденность генетичної коди має безперечний біологічний сенс, забезпечуючи організму ряд переваг. Зокрема, вона сприяє "вдосконаленню" генома, оскільки в процесі мутації можуть наступати різні амінокислотні заміни, найбільш цінні з яких відбираються в процесі еволюції.
Іншою відмітною особливістю генетичної коди є його безперервність, відсутність розділових знаків, тобто сигналів, вказуючих на кінець одного кодону і почало іншого. Іншими словами, код є лінійним, що не уривається: АЦГУЦГАЦЦ. Це властивість генетичної коди забезпечує синтез надзвичайно впорядкованої послідовності молекули білків. У всіх інших випадках послідовність нуклеотидов в кодонах порушуватиметься і приводитиме до синтезу "безглуздого" поліпептидного ланцюга із зміненою структурою. Слід вказати на ще одну особливість коди -- його універсальність для всіх живих організмів: від Е. соli до людини.
Серед 64 мислимих кодонів сенс має 61, тобто кодує певну амінокислоту. В той же час три кодони, а саме УАГ, УАА, УГА є безглуздими, нонсенсом-кодоном, оскільки вони не кодують жодної з 20 амінокислот. Проте ці кодони не позбавлені сенсу, оскільки виконують важливу функцію в синтезі білка в рибосомах (функцію закінчення, термінації синтезу).
При дослідженні генетичної коди в дослідах in vivo були також отримані докази універсальності коди. Проте останнім часом з'ясовані деякі відмінності коди в мітохондріях еукаріот тварин, включаючи людину, що відрізняється чотирма кодонами від генетичної коди цитоплазми, навіть тих же кліток. Зокрема, АУГ, що є зазвичай ініціаторним кодоном, кодує також метіонін в ланцюзі, і УГА, що є нонсенсом-кодоном, кодує в мітохондріях триптофан. Крім того, кодони АГА і АГГ є для мітохондрій що швидше термінують, а не що кодують аргінін. Як результат цих змін, для прочитування генетичної коди мітохондрій потрібний менше за разных тРНК, тоді як система цитоплазми трансляції володіє повним набором тРНК.
Етапи синтезу білка
Синтез білка представляє собою циклічний багатоступінчатий енергозалежний процес, в якому вільні амінокислоти полімеризуються в генетично детерміновану послідовність з утворенням поліпептидів. Система білкового синтезу, точніше, система трансляції, яка використовує генетичну інформацію, транскибіровану в мРНК, для синтезу поліпептидного ланцюга з зазначеною первинною структурою, включає близько 200 типів макромолекул -- білків і нуклеїнових кислот. Серед них близько 100 макромолекул, що беруть участь в активуванні амінокислот і їх перенесенні на рибосоми (все тРНК, аміноацил-тРНК-синтетази), більше 60 макромолекул, що входять до складу 70S або 80S рибосом, і близько 10 макромолекул (званих білковими чинниками), що беруть безпосередню участь в системі трансляції. Не розбираючи детально природу інших важливих для синтезу чинників, розглянемо детально механізм індивідуальних шляхів синтезу білкової молекули в штучній синтезуючій системі. Перш за все, за допомогою ізотопного методу було з'ясовано, що синтез білка починається з N-кінця і завершується С-кінцем, тобто процес протікає у напрямі NH2 ( COOH.
Білковий синтез, або процес трансляції, може бути умовно роздільний на два етапи: активування амінокислот і власне процес трансляції.
Активування амінокислот
Необхідною умовою синтезу білка, який кінець кінцем зводиться до полімеризації амінокислот, є наявність в системі не вільних, а так званих активованих амінокислот, що мають в своєму розпорядженні свій внутрішній запас енергії. Активація вільних амінокислот здійснюється за допомогою специфічних ферментів аміноацил-тРНК-синтетаз в присутності АТФ. Цей процес протікає в дві стадії, причому обидві каталізують одними ферсентом. На першій стадії амінокислота реагує з АТФ і утворюється пірофосфат і проміжний продукт, який на другій стадії реагує з відповідною 3'- ОН-ТРНК, внаслідок чого утворюється аміноацил -тРНК (аа-тРНК) і звільняється АМФ. АМІНОАЦИЛ-ТРНК має в своєму розпорядженні необхідний запас енергії. Необхідно підкреслити, що амінокислота приєднується до кінцевого 3'- ОН-ГИДРОКСИЛУ (або 2'-ОН) АМФ, який разом з двома залишками ЦМФ утворює кінцевий триплет ЦЦА, що є однаковим для всіх транспортних РНК.
Страницы: 1, 2
