Уровень вещества Р и активность ферментов обмена регуляторных пептидов в сыворотке крови спортсменов при физической работе - рефераты, скачать рефераты, бесплатно рефераты

Рефераты. Уровень вещества Р и активность ферментов обмена регуляторных пептидов в сыворотке крови спортсменов при физической работе

ейропептиды играют важную роль в адаптационных процессах, проявляют анальгетические эффекты, участвуют в формировании пищедобывательного и полового поведения [20,22,24,28]. Многие из этих веществ вовлекаются в регуляцию полового созревания [2,5,29,33]. Нейропептиды влия-ют на половую дифференциацию организма (гонадотропин-рилизинг-фактор, ЛГ, ФСГ, пролактин [19,21,34], на процессы внимания и памяти (например, АКТГ и б-меланотро-пин - стимуляторы запоминания и внимания), на эмоциональ-ное поведение (тиролиберин, меланостатин, кортиколиберин - стимуляторы эмоционального поведения), обладают анальгезирующим действием (нейротензин, опиоидные пептиды).

Уровень нейропептидов определяется соотношением скоростей их синтеза и деградации.

Нейропептиды синтезируются в организме на рибосомах гранулярного эндоплазматического ретикулума в виде высокомолекулярных неактивных предшественников (препропептидов) [11,17]. В состав последних могут входить аминокислотная последовательность как одного, так и нескольких нейропептидов. Известно много белков, содержащих в своей структуре последовательности нейропептидов: предшественник гонадотропин-рилизинг-фактора, проопиомеланокортин, препроэнкефалин А, продинорфин (препроэнкефалин В) и другие [26,1].

Все препропептиды содержат на N-конце сигнальную последовательность из 15-20 остатков гидрофобных аминокислот. Нейропептиды, входящие в состав предшественника, как правило, ограничены с C- и N-концов парами остатков основных аминокислот - аргинина и лизина.

Сигнальная последовательность препропептидов необходима для взаимодействия с рецепторами эндоплазматического ретикулума и переноса предшественника нейропепти-да в просвет ретикулума. В цистернах эндоплазматического ретикулума под действием сигнальной эндопептидазы происходит отщепление сигнальной последовательности, а также N-гликозилирование и формирование характерной для полипептида третичной структуры, которая препятствует обратному выходу белка в цитоплазму. Посттрансляционная модификация, включающая гликозилирование, амидирование, ацетилирование или сульфирование, предотвращает нарушение процессинга и образование нетипичных пептидов.

Для получения активных форм, полипептиды подвергаются посттрансляционному процессингу, одним из основных механизмов которого является ограниченный протеолиз [3,6,14].

Процессинг биологически активных пептидов [6,7] осуществляется при передвижении молекул пропептидов по гранулярному эндоплазматическому ретикулуму, комп-лексу Гольджи и в секреторных везикулах [55]. Секреторные везикулы содержат полный набор ферментов, необходимых для процессинга и специальные системы поддержания pH внутри везикул [15].

Процессинг нейропептидов [64] внутри секреторных везикул включает в себя эндо- и экзопротеолитические реакции. Эндопротеолиз осуществляется при действии трипсиноподобных протеиназ (проопиомеланокортин-превращающего фермента [65,66], продинорфин-превращающего фермента [47], тиоловой прогормонконвертазы [39,40], субтилизиновых эндопептидаз семейства фурина, PC1, PC2, PC3 и PC4 [73]. В результате происходит расщепление пропептидов по парам остатков основных аминокислот [15,77].

Продукт, образовавшийся после действия эндопептидаз, далее подвергается экзопротеолизу с участием аминопептидазо-В- и/или карбоксипептидазо-В-подобных ферментов [7,9]. В результате происходит удаление ”лишних” N- и/или С-концевых остатков основных аминокислот.

Известно, что в различных тканях из одного белкового предшественника образуются различные нейропептиды. Так из проопиомеланокортина в аденогипофизе образуются преимущественно АКТГ, в-липотропин и в-эндорфин. В промежуточной доле гипофиза они подвергаются дальнейшему расщеплению с образованием б-меланоцитстимулирующего гормона и фрагментов в-эндорфина [3]. Тканевая специфичность, по-видимому, может быть связана с различным набором ферментов в разных тканях и/или с различными способами регуляции их активности. Поэтому представляет интерес изучение ферментов процессинга со сходной (но не идентичной) субстратной специфичностью. Такие исследования интересны не только для выяснения вопросов, связанных с функционированием данных ферментов, но и для понимания механизмов образования различных нейропептидов из одних и тех же предшественников в разных тканях.

Поскольку карбоксипептидазо-В-подобные ферменты, то есть отщепляющие остатки основных аминокислот (аргинина и лизина) с карбоксильного конца пептидов, участвуют в конечной стадии процессинга биологически активных пептидов, то их изучение представляет особый интерес. Также эти ферменты участвуют в инактивации нейропептидов. В сыворотке крови такими ферментами являются карбоксипептидаза N (КПN) и ангиотензин-превращающий фермент (АПФ).

1.2.1 Карбоксипептидаза N
Карбоксипептидаза N (КПN, энкефалинконвертаза, карбоксипептидаза Е, КФ 3.4.17.10) выделена и охарактеризована из мозга, гипофиза, хромаффинных гранул надпочечников, эндокринных клеток поджелудочной железы. Во всех органах и тканях КПN представлена двумя формами: растворимой и мембраносвязанной. Обе формы являются гликопротеинами, имеют идентичную субстратную специфичность и чувствительность к групп-специфичным реагентам. Молекулярная масса мембранной формы 55-57 кДа, растворимой формы - 53-57 кДа [45,52,53].

Карбоксипептидаза N является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится Zn2+.[54] Фермент имеет оптимум рН 5,5-6,0, активируется ионами Co2+ в 5-10 раз, ионами Ni2+ в 2-3 раза, ингибируется CuCl2, HgCl2, аминопропилмеркаптоянтарной кислотой, 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой, ЭДТА и 1,10-фенантролином. Сульфат цинка, хлорид кальция, N-этилмалеимид и ФМСФ не влияют на активность КПN [78]. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и гуанидинопропилянтарная кислота с Ki 8,8 нМ и 7,5 нМ, соответственно. КПN ингибируется Met- и Leu-энкефалинами, веществом Р, вазопрессином, окситоцином, тиреотропин-рилизинг-фактором [59].

Уровни мРНК КПN и активности КПN в мозге и тканях в целом коррелируют между собой. Наивысшие уровни мРНК КПN обнаружены в пирамидальных клетках гиппокампа, в передней и промежуточной долях гипофиза, эпендимных клетках боковых желудочков мозга, базолатеральной миндалине, супраоптическом и паравентрикулярном ядрах. Средние уровни мРНК КПN у крыс обнаружены в таламусе, медиальном коленчатом ядре, коре мозжечка и промежуточной оливе. Наименьшие уровни выявлены в гранулярном клеточном слое гиппокампа, латеральном гипоталамусе, бледном шаре и в ретикулярной формации ножки мозга.

В клетке КПN локализована, в основном, в секреторных гранулах, причем часто совместно с биологически активными пептидами - инсулином [45], энкефалинами [58], вазопрессином [71], окситоцином [70], веществом P [44], атриальным натрийуретическим фактором.[67].

Она обладает, практически, абсолютной специфичностью по отношению к пептидным субстратам с С-концевыми остатками основных аминокислот. КПN хорошо отщепляет остатки лизина и аргинина от Arg8-вазопрессин-Gly-Lys-Arg [71], а также превращает 125I-Met-энкефалин-Arg6 и 125I-Met-энкефалин-Lys6 в 125I-Met-энкефалин. Фермент отщепляет остатки -Lys15-Lys16-Arg17 с карбоксильного конца фрагмента АКТГ (АКТГ1-14) и остатки аргинина с С-конца гиппурил-L-Arg и Leu-энкефалин-Arg [58]. КПN с очень низким сродством отщепляет остаток гистидина с карбоксильного конца проокситоцина [76].

Следует отметить, что уровень мРНК КПN способен быстро изменяться в ответ на внешние воздействия, вызывающие изменения уровня биологически активных пептидов или уровня их мРНК. Кроме того, в случае синтеза дефектной (неактивной КПN) (мутация в гене, кодирующем КПN) наблюдается нарушение синтеза и секреции многих биологически активных пептидов.

Физико-химические свойства, субстратная специфичность, тканевая, клеточная и субклеточная локализация, особенности изменения активности фермента при различных фармакологических воздействиях на организм и культуры клеток [13], нарушение синтеза нейропептидов у мышей с дефектной КПN свидетельствуют о том, что исследуемый фермент вовлекается в процессинг многих биологически активных пептидов, таких как энкефалины, АКТГ, -эндорфин, вазопрессин, окситоцин, нейротензин, меланоцитстимулирующий горомон, вещество Р и др. [6], а также участвует в (алкоголизм, стресс, болезнь Альцгеймера, в общем, в адаптационных процессах. [31]

1.2.2 Пептидилдипептидаза А

Ангиотензинпревращающий фермент (АПФ, дипептидил-карбоксипептидаза A, кининаза II, карбоксикатепсин, пептидилдипептидаза А, КФ 3.4.15.1) обладает пептидилдипептидазной и слабыми трипептидилкарбоксипептидазной и эндопептидазной активностями [50]. Он выделен и очищен из разных тканей, в том числе из мозга, различных видов животных[46]. Фермент из всех тканей (эндотелиальная форма), за исключением семенников (тестикулярная форма), имеет очень близкие физико-химические и иммунологические свойства, тогда как фермент из семенников отличается от ангиотензинпревращающего фермента из других источников по молекулярной массе и иммунологическим свойствам.

В мозге обнаружена только эндотелиальная форма. Она состоит из одной полипептидной цепи, имеет молекулярную массу 170-180 кДа и содержит около 13% остатков нейтральных сахаров. Эндотелиальная форма состоит из двух гомологичных доменов, каждый из которых имеет активный центр и центр связывания Zn2+ [10].

Отличия в степени гликозилирования приводят к образованию двух иммунологически идентичных форм, одна из которых (эндотелиальная) с молекулярной массой 180 кДа присутствует, исключая семенники, во всех тканях, в том числе и мозге, а вторая (нейрональная) с молекулярной массой 170 кДа - обнаруживается только в мозге, и не присутствует в других тканях.[41]

Имеются единичные сообщения об обнаружении в различных органах и тканях более высокомолекулярных каталитически активных форм АПФ с молекулярной массой 600 кДа, 430 кДа, 330 кДа, 240 кДа, иммунологически полностью идентичных эндотелиальной форме. В настоящее время неясно, являются ли эти формы предшественниками АПФ, или образуются при гель-фильтрации благодаря склонности молекул фермента, как и других мембраносвязанных белков, к агрегации. pI фермента из различных органов и тканей колеблется в пределах от 4,6 до 5,1, что обусловливает дополнительную гетерогенность фермента при электрофоретическом разделении. Полагают, что гетерогенность АПФ может иметь важное значение для избирательности регуляции его активности в различных тканях. [25].

АПФ из различных источников имеет оптимум pH 7,6-8,2, для проявления максимальной активности необходимы ионы Cl- .[30] АПФ содержит 1 прочно связанный ион Zn2+ на каждый активный центр и сильно ингибируется хелатирующими агентами, такими как ЭДТА и о-фенантролином [61]. Фермент ингибируется брадикининпотенциирующим фактором (Ki 40 нМ), дитиотреитолом, 2-меркаптоэтанолом и додецилсульфатом натрия. N-этилмалеимид, бацитрацин, пуромицин, фосфорамидон, тиорфан, ингибитор металл-зависимых основных карбоксипептидаз ГЭМЯК не влияют на его активность [10]. Создан целый класс пептидных аналогов субстратов АПФ с Ki порядка 10-50 нМ, наиболее известные из них каптоприл (IC50 20 нМ), еналаприл (IC50 25-35 нМ), лизиноприл (IC50 3-10 нМ) [49].

Фермент in vitro катализирует расщепление в общей сложности более 30 биологически активных пептидов и их предшественников [75]. Он превращает ангиотензин I в ангиотензин II (Km 4-70 мкМ), последовательно отщепляет два дипептида с C-конца брадикинина, расщепляет неокиоторфин с образованием киоторфина (Km 0,58 мМ), Met-энкефалин-Arg6-Phe7 с образованием Met-энкефалина (Km 0,30 мМ), вещество P и вещество K, холецистокинин и гастрин, энкефалин, нейротензин, нейрокинины A и B, рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона. АПФ катализирует образование Met-энкефалин-Arg6 из Met-энкефалин-Arg6-Gly7-Leu8, отщепляет последовательно два дипептида с C-конца динорфина A 1-8, расщепляет натрийуретический фактор из мозга и предсердий, вазопрессин, окситоцин.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5