Структура й обсяг дисертації. Робота викладена на 189 сторінках машинописного тексту й складається із вступу, огляду літератури, методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків і списку цитованої літератури, що включає 280 найменувань. Робота ілюстрована 16 таблицями й 23 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури містить аналіз сучасного стану питання про молекулярні механізми формування оксидативного стресу і його значення в адаптації організму до несприятливих зовнішніх впливів і розвитку патологічних процесів. Особлива увага приділяється розгляду даних літератури про особливості перебігу вільнорадикальних процесів у тканинах внутрішніх органів при гіпотиреозі й інтенсивному фізичному навантаженню.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження виконане на 144 щурах-самцях лінії Вістар, які втримувалися в умовах віварію Харківської медичної академії післядипломної освіти й забезпечувалися стандартним раціоном харчування. Тварин ділили на дві вікові групи: дорослі статевозрілі - 10 - 12 місяців (маса 240 - 360 г) і молоді, що перебувають у періоді статевого дозрівання - 1,5 місяця (маса 80- 90 г). Кожну групу ділили на чотири підгрупи: 1 - інтактні, 2 - щури, які піддавалися інтенсивному фізичному навантаженню (плаванню до “відмови”), 3 - тварини, у яких відтворювався експериментальний гіпотиреоз, 4 - щури з експериментальним гіпотиреозом, яких піддавали інтенсивному фізичному навантаженню.

Для відтворення експериментального гіпотиреозу тваринам внутрішньоочеревинно вводився антитиреоїдний препарат мерказоліл з розрахунку 1 мг препарату на 100 г маси тварини. Препарат розчинявся в ізотонічному розчині хлористого натрію. Введення проводилося щодня протягом 15 днів (Krasilnikova O.A. et al., 2002).

Ефективність відтворення експериментального гіпотиреозу контролювалася шляхом визначення в крові концентрації тиреоїдних гормонів (тироксину, трийодотироніну) і тиреотропіну. Дослідження проводилися з використанням наборів для імуноферментних досліджень фірми “DAI” (США) на імуноферментному аналізаторі “HUMAREADER” (Німеччина).

З метою відтворення моделі інтенсивного фізичного навантаження щури піддавалися плаванню до “відмови” у круглих пластикових ємностях діаметром 40 см. Через годину після плавання тварини піддавалися евтаназії, відповідно до умов евтаназії, зазначених в методичних рекомендаціях МОЗ України та загальних етичних принципів проведення експериментів на тваринах, узгоджених з положеннями “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей”.

З півкуль головного мозку за допомогою скляного гомогенізатора Поттера-Ельвегейма готувалися 10 % гомогенати на 0,32 М сахарозі (рН 7,4). Отримані гомогенати піддавалися фракціонуванню за допомогою методу диференціального центрифугування з метою одержання мітохондріальної, мікросомальної і постмітохондріальної фракцій.

У субклітинних фракціях півкуль головного мозку проводилося визначення концентрації карбонільованих білків і продуктів вільнорадикального окислення ліпідів (основ Шиффа і дієнових кон'югатів). Вимір вмісту карбонільованих білків (КБ) проводився за методом Дубиніної Є.Є. (2000). У розрахунках використовувався коефіцієнт молярної екстинкції, що відповідає 2,1 . 104 М-1 . см-1. Визначення основ Шиффа (ШО) проводилося за допомогою флюорометричного методу (Rice-Evans C.A. et al., 1991). В основу виміру концентрації дієнових кон'югатів (ДК) був покладений спектрофотометричний метод Стальної І.Д. (1977). При розрахунках змісту дієнових кон'югатів використовувався коефіцієнт молярної екстинкції, що відповідає 2,2 . 105 М-1 . см-1. .

У мітохондріальній і мікросомальній фракції півкуль головного мозку досліджувалася швидкість індукованого ПОЛ та індукованого вільнорадикального окислення білків. Для цього 0,1 мл досліджуваної проби субклітинної фракції змішували з 1,5 мл 0,015 М фосфатного буфера (рН 7,4). Після трихвилинної преінкубації при 37 °С, у реакційну суміш вносили 0,2 мл 0,01 М солі Мора й 0,2 мл 1 М перекису водню. Проби інтенсивно перемішували й інкубували протягом 10 хвилин при 37 °С. Після цього реакція зупинялася за допомогою додавання трихлоруксусної кислоти до кінцевої концентрації 5 %. Проби центрифугували 15 хвилин при 3000 об/хв. В отриманому в такий спосіб осаді вимірювали вміст карбонільованих білків (Дубиніна Є.Є., 2000), а в супернатанті - ТБК-реактивних речовин. Визначення концентрації ТБК-реактивних речовин проводилося по реакції з 2-тіобарбітуровою кислотою. У розрахунках використовували коефіцієнт молярної екстинкції малонового діальдегіду, що відповідає 1,53 . 105 М-1 . см-1 (Esterbauer H. et al., 1990).

Для оцінки стану першої лінії антиоксидантного захисту в мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях півкуль головного мозку вимірялася активність каталази (Барабой В.А. й ін., 1991) і супероксиддисмутази (Костюк В.А., 1990).

Вимір вмісту білка в аналізованих пробах визначали за Lowry O. et al. (1955).

Отримані результати піддавалися статистичній обробці з використанням непараметричного методу Wilcoxon-Mann-Whitney. Розходження між даними вважалися достовірними при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ та ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Проведені дослідження показали, що в мозку щурів з експериментальним гіпотиреозом виникає стан оксидативного стресу. Його проявом служить накопичення в них у мітохондріальній і мікросомальній фракції великих півкуль головного мозку продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків (табл. 1 і 2).

Підвищення інтенсивності вільнорадикального окислення ліпідів у мікросомальній фракції мозку в щурів з гіпотиреозом супроводжується збільшенням у ній вмісту дієнових кон'югатів, при відсутності накопичення основ Шиффа. При цьому виникає підвищення індексу співвідношення ДК/ШО в мікросомах мозку щурів обох вікових груп, порівняно з його вихідною величиною (рис. 1).

Таблиця 1

Вміст продуктів ПОЛ у субклітинних фракціях великих півкуль головного мозку інтактних щурів і тварин з експериментальним гіпотиреозом (M + m; n = 5 - 6)

Примітки: * - Р< 0,05 порівняно з інтактними; ** - Р< 0,05 порівняно з інтактними 1,5-місячними.

Виникнення подібного зрушення в співвідношенні початкових і кінцевих продуктів ПОЛ, може бути пов'язане зі зміною переважних шляхів метаболізму проміжних продуктів вільнорадикального окислення ліпідів, до числа яких можна віднести численні карбонільні сполуки й, у тому числі, ендогенні альдегіди. В умовах стимуляції перекісного окислення ліпідів у мікросомах це зрушення здобуває адаптивного значення, спрямованого на обмеження ушкоджуючої дії оксидативного стресу (Davydov V.V. et al., 2004).

Таблиця 2

Вміст карбонільованих білків (нмоль/мг білка) у субклітинних фракціях мозку інтактних щурів і тварин з експериментальним гіпотиреозом (M + m; n = 5 - 6)

Примітки: 1) КБ363 - карбонільовані білки, фенілгідразони яких мають максимум світлопоглинання при 363 нм; КБ370 - карбонільовані білки, фенілгідразони яких мають максимум світлопоглинання при 370 нм;

2) * - Р< 0,05 порівняно з інтактними; ** - Р< 0,05 порівняно з інтактними 1,5-місячними.

Рис. 1. Величина співвідношення ДК/ШО в мікросомальній фракції півкуль головного мозку 1,5- (світлі стовпчики) і 12-ти місячних - (темні стовпчики) щурів з експериментальним гіпотиреозом. Примітка. * - Р< 0,05 порівняно з інтактними.

Отримані дані про виникнення оксидативного стресу в півкулях головного мозку щурів з експериментальним гіпотиреозом відповідають відомостям інших авторів (Das K. et al., 2004). Разом з тим, у цьому дослідженні вперше встановлений факт існування характерних вікових рис у прояві оксидативного стресу в мозку при досліджуваній патології. Основним їхнім проявом є більша виразність оксидативного стресу при гіпотиреозі в мозку в дорослих статевозрілих тварин, ніж у щурів у періоді статевого дозрівання. Підтвердженням цього є дані про неоднаковий рівень накопичення в щурів у субклітинних фракціях півкуль головного мозку продуктів вільнорадикального окислення. В мітохондріях мозку в дорослих щурів з гіпотиреозом відбувається збільшення концентрації ДК, ШО й карбонільованих білків на 133, 55 і 91 % відповідно, у порівнянні з їхнім вихідним рівнем (табл. 1). У той же час у тварин пубертатного віку відбувається тільки підвищення концентрації карбонільованих білків на 76 % порівняно з інтактними щурами цієї вікової групи (табл. 2). Причому, у мітохондріях мозку дорослих тварин і щурів пубертатного віку накопичуються різні фракції карбонільованих білків: в 12-ти місячних - карбонільовані білки, фенілгідразони яких мають максимум світлопоглинання при 370 нм (КБ370) , а в 1,5-місячних - при 363 нм відповідно (КБ363). Виникаюче зрушення обумовлює появу в них різноспрямованих змін з боку індексу співвідношення КБ363/КБ370 у мітохондріальній фракції мозку.

Страницы: 1, 2, 3, 4