В ходе исследований экспрессии генов семейства Y-бокс белков, регулирующих процессы транскрипции в клетках, было установлено, что высококонсервативный элемент основы промотора grp78 играет важную роль в индукции grp78 под разнообразными стрессовыми сигналами. Предшествующее изучение установило функциональную область в 3' конце основы промотора, которая проявляет стресс-индуцируемые изменения в стрессированных ядрах. В ходе экспериментов показано, что человечески фактор транскрипции YY1 связывает SICR и трансактиваторный элемент основы промотора в условиях стресса. Скрининг библиотек с данным элементом промотора выявил два новых связывающих эту область промотора белка, YB-1 и DBPA. Оба белка принадлежат к семейству Y-бокс белков, для которых характерен эволюционно- устойчивы ДНК-связывающий мотив - домен холодового шока. В ходе исследований в экспериментах по ко-переносу было установлено, что Y-бокс белки выступают в стрессированных клетках антагонистами WI-опосредованного управляемого grp78 усиления транскрипции. Таким образом, белки, имеющие домен холодового шока, могут быть частью механизма передачи сигнала стресса у млекопитающих.
В то же время проблематично существование особых факторов транскрипции для специфических функци в элементах промотора, особенно в таких системах, как G-бокс, поскольку существуют многочисленные синергические специфические для G-бокса факторы, в частности, промотора алкогольдегидрогеназы у Arabidopsis, которы регулирует экспрессию в ответ на холодовое возде ствие и обезвоживание.
12. Гены, связанные с низкотемпературной акклиматизацией
В ходе исследований по изучению влияния низкотемпературно акклиматизации на экспрессию генов в растениях выявлено и охарактеризовано значительное число генов, экспрессия которых индуцируется во время этого процесса как в травянистых, так и в древесных растениях. Значительное число этих генов индуцируется также экзогенно абсцизово кислото и засухо. В то же время выявлены гены, которые специфичны для процесса акклиматизации растения к низким температурам и не индуцируются другими типами абиотического стресса.
Для установления молекулярных основ холодово акклиматизации у клубники было проведено выявление генов, ассоциированных с низкотемпературно акклиматизацие.
Дифференциальный скрининг библиотеки кДНК, изготовленно из акклиматизированных к холоду растений клубники, позволил изолировать различные кДНК, дифференциально экспрессирующиеся при низкотемпературно акклиматизации. Нозерн-блот анализ показал, что уровень транскриптов Fcor1 возрастал после 2 дне низкотемпературно акклиматизации, в то время как аналогичны показатель Fcor2 увеличивался только после 2 недель низкотемпературно акклиматизации. С друго стороны, уровень содержания транскриптов Fcor3 снижался в течение 24 часов воздействия низкотемпературно акклиматизации и оставался на низком уровне в течение 8 недель периода акклиматизации. Гены Fcor1 и Fcor2 экспрессируются во всех тканях, в то время как ген Fcor3 специфичен для листьев. Кодируемы геном Fcor1 белок имеет высокое содержание ле цина, изолейцина, глицина, пролина и серина. Данный белок имеет гомологию с белками, кодируемыми геном ячменя blt101, индуцируемым низкотемпературно акклиматизацие, и геном Lophopyrum esi3, индуцируемым солевым стрессом. Белок FCOR2 богат лизином, лейцином, валином, аланином и аргинином и не имеет гомологии ни с каким из продуктов известных генов. Частичны клон кДНК Fcor3 кодирует полипептид, имеющий очень высокую идентичность с субъединице V PSI из шпината и с полипептидом PSI Psag из ячменя. Уровень накопления транскриптов Fcor1 коррелирует с устойчивостью к замораживанию у исследованных сортов клубники.
Клон кДНК pbn59 был изолирован путем дифференциального скрининга библиотеки кДНК акклиматизированного к холоду озимого рапса. Нуклеотидная последовательность BN59 оказалась гомологичной последовательности, кодирующей 70 кДа субъединицу вакуолярной Н+-АТФазы в растениях. Транскрипты, гибридизующиеся с BN59, аккумулируются во время воздействия низко температуры и воздействия экзогенно абсцизовой кислоты. Вестерн-блоттинг белков также показал увеличение содержания 70 кДа субъединицы во время акклиматизации к холоду. Накопление эндомембранной Н+-АТФазы следует также из наблюдений за осмотическим регулированием, увеличением содержания эндогенно абсцизово кислоты и пролиферации эндомембран в течение холодной акклиматизации.
Двенадцать клонов индуцируемых холодом кДНК были изолированы путем дифференциального скрининга библиотеки кДНК, подготовленной из мРНК холодоустойчивого картофеля. При помощи нозерн-блот гибридизации было проанализировано накопление мРНК, соответствующей каждому клону. Изолированные в данном исследовании клоны кДНК обозначены как Ssci. Все клоны отчетливо индуцировались в ответ на холод -накопление соответствующих транскриптов было замечено уже после одного дня закаливания к холоду. Максимальная аккумуляция мРНК, соответствующих клонам Ssci1, Ssci2, Ssci6 и Ssci8, была отмечена в первы день холодового закаливания, тогда как для клонов Ssci3, Ssci4, Ssci5, Ssci7, Ssci9, Ssci10, Ssci11 и Ssci12 - после 8 дне закаливания. Частичная последовательность ДНК была определена для 5' и 3' концов клонов и был произведен поиск гомологии с последовательностями в базах данных. Результаты поиска показали, что выделенные клоны кДНК соответствуют известным генам и кодируют мРНК для следующих белков: мРНК для двух различных S-аденозил-L-метионин декарбоксилаз, два хлоропластных шаперонина, белок цикла деления клетки CDC48, малатдегидрогеназу, мио-инозитол-1-фосфат синтетазу, протопорфирин IX:Mg хелатазу, фактор элонгации EF-1a, хлоропластный фактор элонгации трансляции EF-G, рибосомальный белок L-3 и мРНК для белка томата TAS14, индуцируемого экзогенно абсцизовой кислото. Выявленные гены могут участвовать в двух различных механизмах, относящихся к холодоустойчивости. Одна группа может предохранять хлоропласты и клеточные структуры во время стресса, в то время как другая может быть вовлечена в механизмы приспособления растительной клетки к холоду
Были изучены некоторые из ответов мутантов Arabidopsis thaliana L., не развивающих максимальной холодостойкости после холодовой акклиматизации, на холодовое воздействие. В ходе экспериментов были изучены холодовая индукция трех белков, уровни содержания сахарозы и глюкозы, жирнокислотный состав липидов, а также накопление антоцианинов в листьях. Четыре мутации понижали или устраняли накопление антоцианина во время холодно акклиматизации. Одна мутация предотвращала индуцируемое холодом в норме повышение уровня содержания сахарозы и глюкозы. Мутации sfr4 и sfr7 влияли на жирнокислотный состав липидов после холодовой акклиматизации. С другой стороны, поскольку все исследованные параметры у мутаций sfr1, sfr2 и sfr5 не отличались от таковых у дикого типа, то предполагается, что они имеют другое, вполне возможно, высокоспецифическое действие в ответ на низкотемпературное воздействие.
Регулируемый холодом оперон rbpA1-rpsU кодирует РНК-связывающий белок и рибосомальный белок M3 у Anabaena variabilis. Уровень экспрессии этой группы генов примерно в десять раз выше при температурах ниже 30 0C, чем при 38 0C. С целью изучения функций белка RbpA1 in vivo был создан нарушенный вставкой ген rbpA1. Эти мутанты были полностью лишены белка RbpA1, но содержали нормальны уровень продукта гена rpsU - рибосомального белка S21. При 38 0C мутанты были морфологически нормальными, но при 22 0C они с небольшой частотой производили необычные клетки. По-видимому, эти клетки были на начальном этапе образования прогетероцист. В присутствии нитрата при 22 0C у мутантов на молекулярном уровне также происходили различные события, обуславливающиеся инициацией превращения в гетероцисты, а именно, иссечение 11-kbp элемента ДНК в nifD и накоплении копи xisA и hetR, но в то же время эти события не происходили в присутствии аммония или при 38 0C. Полученные результаты позволяют считать, что RbpA1 необходим для полно репрессии инициации образования гетероцист при низких температурах в присутствии нитрата.
В ходе изучения низкотемпературного ответа генома Arabidopsis thaliana были охарактеризованы две связанные кДНК, соответствующие генам, экспрессия которых временно индуцируется низкими температурами. RCI2A и RCI2B кодируют небольшие сильно гидрофобные белки, которые несут два потенциальных трансмембранных домена. Анализ их аминокислотно последовательности показал сродство с регулируемыми различными стрессовыми условиями белками, кодируемыми генами из ячменя и Lophophyrom elongatum. Их высоки уровень гомологии последовательностей и их геномная локализация в отдельном рестрикционном фрагменте подтверждают то, что оба гена появились в результате тандемной дупликации. В то же время их регулирующие последовательности достаточно различаются для того, чтобы считать их различными генами. Подобно большинству охарактеризованных индуцируемых холодом генов растений, экспрессия RCI2A и RCI2B также усиливается экзогенно абсцизовой кислотой и дегидратацией, но не обще реакцией растения на стрессовые условия, поскольку она не индуцируется солевым стрессом или анаэробиозом. Более того, низкая температура способна вызвать экспрессию RCI2A и RCI2B в ABA-дефицитной и нечувствительной генетической среде, что свидетельствует о том, что низкотемпературны ответ этих двух генов регулирует и зависимые от абсцизово кислоты, и независимые от нее пути.
Для изучения генетического регулирования морозоустойчивости рапса у популяции F2 Brassica rapa и двойно гаплоидно популяции Brassica napus in vitro определялась относительная морозоустойчивость акклиматизированных и неакклиматизированных растений. Для идентификации предполагаемых локусов количественных признаков использовались разработанные раньше карты связе. У популяции B. napus области генома со значительным влиянием на морозоустойчивость не были обнаружены, но у B. rapa четыре области ассоциировались со связанно с акклиматизацией морозоустойчивостью и способностью к акклиматизации, но две другие области связывались с морозоустойчивостью, не связанно с акклиматизацией. Способность к акклиматизации регулировалась генами с очень небольшими как положительными, так и отрицательными эффектами доминирования. Аллель озимых родителе имела положительные добавочные эффекты, но отрицательные доминантные эффекты в локусах количественных признаков FTN. RFLP локусы обнаруживались при помощи индуцируемо холодом и связанно со стрессом кДНК из Arabidopsis thaliana, картированно около двух локусов количественных признаков для FTA/FTB.
Недавние исследования определили в растениях cis-действующий ДНК-регулирующий элемент, «C-повтор/отвечающий на обезвоживание элемент », которы стимулирует транскрипцию в ответ на де ствие низко температуры и водного дефицита. Из Arabidopsis thaliana была выделена кДНК, которая кодирует «C-repeat/DRE» связывающий фактор, CBF1. Анализ выведенной аминокислотной последовательности CBF1 показывает, что белок имеет молекулярную массу 24 кДа, потенциальную ядерную локализацию последовательности и возможную активность в кисло области. CBF1 также имеет область AP2, которая является ДНК-связывающим мотивом из 60 аминокислот, имеющимся в белках Arabidopsis APETALA2, AINTEGUMENTA, и TINY и в других растительных белках с неизвестными функциями. Уровни содержания транскриптов CBF1, которые конститутивной являются единичными или низкими, незначительно изменялись в растениях, подвергнутых низкотемпературно обработке, или в отдельных листьях, подвергнутых дефициту воды. Связывание CBF1 к «C-repeat/DRE» продемонстрировано при помощи анализа со сдвигом геля при использовании рекомбинантного белка CBF1, экспрессированного в Escherichia coli. Кроме того, обнаружено, что экспрессия CBF1 в дрожжах активизирует транскрипцию репортер-генов, содержащих «C-repeat/DRE» как активизатор, расположенный выше последовательности, но не активизирует транскрипцию мутантно версии элемента ДНК. Считается, что CBF1 может функционировать как активизатор транскрипции, который связывается с «C-repeat/DRE» ответственным элементом ДНК и, вероятно, играет роль в индуцированной холодом и обезвоживанием экспрессии гена у Arabidopsis.
Из обработанных холодом проростков холодоустойчивого сорта сои при помощи дифференциального секвенирования были выделены две регулируемые холодом кДНК - src1 и src2. Уровень содержания транскриптов src1 увеличивается после воздействия низкой или высокой температурой, засухой, ранением и инфекцие вирусом мозаики соевого боба. Транслированный из кДНК src1 полипептид имеет 102 аминокислоты, гидрофилен и имеет девять аминокислотных повторов, богатых глютаминовой кислотой, гистидином, лизином и глицином. SRC1 имеет гомологию с белком водного стресса риса и регулируемым холодом белком люцерны. Уровень содержания транскриптов src2 увеличивался только после понижения температуры до 50C, что указывает на то, что этот ген индуцируется только охлаждением. Транслированны из кДНК src2 полипептид состоит из 290 аминокислот и содержит семь повторов последовательностей аминокислот, богатых пролином, глицином, тирозином и глутамином и гидрофобную область у карбокси-конца, которая может связываться с мембраной. Уровень транскриптов src2 при 50C продолжал увеличиваться вплоть до 48 часов де ствия низко температуры в холодоустойчивом сорте Kitamusume, в то время как он достигал максимума через 12 часов и затем понижался в чувствительном к холоду сорте Koganejiro.
Из Arabidopsis thaliana был изолирован геномный фрагмент EcoRI размером 7 kb, которы содержит два тесно связанных dhn/lea/rab-подобных гена - lti29 и cor47 в тандемном оформлении. Для обоих транскриптов показана аккумуляция в ответ на низкотемпературны стресс, обработку экзогенно абсцизово кислото и обезвоживание. Сравнение последовательносте аминокислот транслированных полипептидов показало, что они на 67% идентичны. Рассчитанные молекулярные массы этих полипептидов были 29 кДа для
LTI29 и 30 кДа для COR47. Оба полипептида содержат один консервативны сериновый домен и три богатых лизином повтора, как у DHN/LEA/RAB-подобных белков. Кроме того, как LTI29, так и COR47 имеют N-терминальный кислый повтор, обнаруживаемый только у нескольких среди DHN/LEA/RAB белков. Близкое расстояние между двумя генами и их тандемная организация в геноме A. thaliana, а также общая гомология последовательности области кодирования на нуклеотидном уровне позволяют предположить, что два гена развились путем дублирования. Это, по-видимому, представляет собой общую черту среди зависимых от низкотемпературного стресса генов A. thaliana.
Paldi с соавторами был изучен эффект низко температуры на процессинг рРНК у пшеницы. Две линии пшеницы, использованные в это работе, отличались друг от друга только морозоустойчивостью. В ходе экспериментов было показано, что в случае слабоморозоустойчиво линии количественные и качественные изменения в процессе созревания рРНК произошли как результат де ствия низко температуры. В течение холодово обработки последние предшественники двух стабильных цитоплазматических рРНК накапливались в качестве стабильных фракций рРНК. Это накопление увеличивалось по мере увеличения продолжительности холодовой обработки. В то же время это изменение не было выявлено у линии с хороше морозоустойчивостью. Результаты свидетельствуют, что в слабоморозоустойчивых линиях холодовая обработка имела ингибирующи эффект на последнюю стадию процесса созревания рРНК, то есть при низко температуре этот процесс не может завершиться.
Известно, что тепловая обработка плодов помидора индуцирует также и устойчивость к повреждению от охлаждения. Ранее было показано, что специфические белки теплового шока экспрессируются в нагретых плодах помидора после хранения на холоде. Для поиска индуцируемых теплом генов, экспрессирующихся при низких температурах, была изготовлена, а затем подвергнута дифференциальному скринингу библиотека кДНК из предварительно прогретых, а затем охлажденных плодов помидора. В ходе этих экспериментов был выделен новы клон кДНК, hcit2, кодирующий белок с молекулярно массой 16.5 кДа. Кодируемы им белок содержит три предполагаемых трансмембранных гидрофобных последовательности, что позволяет предполагать, что этот белок локализован в мембранах. Экспрессия hcit2 в плодах индуцировалась высоко температурой, но не иными видами стресса, такими, как, например, низкая температура, засуха или анаэробные условия, и не наблюдалась во время созревания плода. Высокий уровень транскриптов hcit2 был обнаружен в нагретых плодах после 2-х недель хранения при 20C. Высокие температуры также индуцировали экспрессию hcit2 в листьях, цветах и стеблях помидора. Авторы предполагают, что белок HCIT2 может быть вовлечен в процесс приобретения растением устойчивости к повреждению охлаждением.
У ряда лини дикого картофеля были проанализированы динамика холодового закаливания и изменения в транслируемых мРНК во время холодово акклиматизации. Перед низкотемпературно обработкой все линии были полностью закалены в течение восьми дне при 40C. Наиболее холодостойкая линия 1 усилила холодостойкость от -3,20C до - 8,90C, а наименее холодостойкая линия 10 увеличила свою холодостойкость от -2,50C до -6,50C. В ходе исследований были изолированы поли-РНК из закаленных и незакаленных растений лини 1 и 10 и продукты их трансляции in vitro были разделены двумерным-PAGE-электрофорезом. Анализ профилей продуктов трансляции in vitro закаленных растений линии 1 обнаружил изменения в содержании приблизительно 31 продукта в области молекулярных весов от 14 до 69 кДа и pI в районе от 6,7 до 5,0. Содержание 26 продуктов во время холодно акклиматизации повышалось, а двух других белков - уменьшалось. Во время, когда растения подвергались низкотемпературному стрессу, было возможно идентифицировать вновь образующиеся продукты трансляции - три с мол. массами около 18 кДа и два с мол. массами около 45 кДа. Большинство продуктов, содержание которых изменялось в течение холодовой акклиматизации, было обнаружено в группе низкомолекулярных белков с молекулярными массами от 14 до 21 кДа и от 24 до 35 кДа. В менее устойчиво линии 10 в течение холодовой акклиматизации изменялось содержание только 19 продуктов трансляции, и в ней не было отмечено вновь образующихся продуктов. Все изменения в продуктах трансляции в обеих линиях появлялись после двух дне холодовой обработки, когда морозоустойчивость линий еще повышалась.
Таким образом, к настоящему времени накоплено большое количество данных об отдельных индуцируемых низкой температурой генах у различных видов растений. Особенно большой объем данных в настоящее время получен в связи с проводимым полным сиквенсом генома Arabidopsis thaliana. В то же время необходимо отметить, что, несмотря на обилие данных о влиянии низко температуры на экспрессию генов в растениях, эти исследования проводятся отрывочно и бессистемно. В основном, полученные данные говорят об индукции экспрессии определенных генов низко температурой. В то же время данные о взаимосвязи экспрессии различных генов при низкотемпературном стрессе крайне ограничены. Все же из рассмотренных выше данных можно сделать вывод, что, хотя по сравнению с «нормальными» температурными условиями содержание ДНК при гипотермии меняется незначительно, в то же время гипотермия вызывает значительные изменения в экспрессии генов на уровне транскрипции. При низкотемпературном стрессе и в процессе низкотемпературно адаптации у разных исследованных видов индуцируется экспрессия ряда генов, некоторые из которых являются видоспецифичными. В то же время выделено несколько семейств генов, которые индуцируются в ответ на низкотемпературны стресс у многих из исследованных видов. Установлено, что многие из экспрессирующихся при низко температуре генов индуцируются также в ответ на обработку экзогенно абсцизово кислото и засуху. Индукция некоторых генов является общим неспецифическим ответом организма на стресс, так как они индуцируются всеми изученными видами абиотического и биотического стресса. Поскольку установлено, что низкотемпературны стресс вызывает изменения экспрессии генов на уровне транскрипции, можно пере ти к рассмотрению результатов, полученных при изучении его влияния на уровне трансляции.
Страницы: 1, 2, 3, 4
