При гель-фильтрации установлена Mr 42000, а при аналитическом ультрацентрифугировании - 43300. В плаценте протеиназа локализована в ворсинах синцитиотрофобласта.
Катепсин D - эндопептидаза, гидролизующая пептидные связи, образованные остатками гидрофобных аминокислот, один из которых - ароматический. Лучшим субстратом является гемоглобин. Фермент раcщепляет многие природные субстраты: вещество Р, соматостатин, пролактин , -липотропин, -эндорфин.
Катепсин D участвует в регуляции развития клетки и ее программируемой гибели, что связано с процессами в системе протеолиз-антипротеолиз, в которой происходит нарушение баланса при ХВГП. Поэтому представляет интерес изучение активности катепсина D при патологическом течении беременности.
1.4. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная система фетоплацентарного комплекса при физиологической беременности и хронической внутриутробной гипоксии плода
При физиологической беременности скорость инициированного окисления липидов повышается примерно в 3 раза. Во время беременности в связи с возрастанием основного обмена и увеличением потребления кислорода в крови происходит ряд значительных биохимических изменений: повышается концентрация нейтрального жира, холестерина и липидов [3]. Также увеличивается активность фосфолипазы А2. В результате ее действия в крови увеличивается концентрация ненасыщенных жирных кислот, которые являются непосредственным субстратом для перекисного окисления [15]. Нарушения в системе перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной активности (АОА) являются одним из механизмов формирования антиоксидантной недостаточности вследствие чрезмерного усиления ПОЛ. В результате активации ПОЛ и накопления свободных радикалов происходит нарушение структурно-функциональной целостности клеточных мембран, освобождение лизосомальных ферментов, что в конечном итоге приводит к патологическим процессам в клетке и организме в целом [2, 3, 33]. В настоящее время можно считать в основном расшифрованными механизмы альтерации и реакцию клеточных мембран на повреждение. В конечном итоге они обусловлены свободно-радикальной агрессией и процессами перекисного окисления липидов и белков - важнейших компонентов клеточной стенки [4]. Активатором перекисного окисления служат свободнорадикальные формы кислорода. Субстратом ПОЛ являются полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК). Дефицит ПНЖК нарушает барьерную и матричную функции клеточных мембран. Об этом свидетельствует повышение параметра упорядоченности липидного бислоя мембраны (микровязкости мембран) [37]. Одновременно с этим отмечено выраженное уменьшение гидрофобности мембран, а, следовательно, увеличение гидрофилии липидного бислоя, и как следствие - его повышенную проницаемость. Нарушение барьерной функции липидного бислоя мембран сопряжено с изменением функционирования каналов для ионов, в первую очередь Са2+, а также - Na+, K+, Mg2+. Массивный вход Са2+ в клетку приводит к необратимым изменениям в ней, в частности к энергетическому голоду и ее гибели, с одной стороны, а с другой - дополнительно к мышечной контрактуре и вазоспазму. Диеновые коньюгаты, являющиеся первичным продуктом перекисного окисления, увеличивают полярность гидрофобных углеводородных хвостов жирных кислот, которые образуют липидный бислой мембраны. При физиологическом процессе регуляции клеточной активности участки углеводородных хвостов, полярность которых возросла, вытесняются из глубоких слоев мембраны к поверхности, что облегчает процесс самообновления мембраны и влияет на ее проницаемость и ионный транспорт. При избыточном появлении свободнорадикальных форм кислорода самоускоряющееся ПОЛ приводит к полному разрушению ненасыщенных липидов, нарушению структуры и функции белков и других молекул и, как следствие, к гибели клетки [3, 15].
Одним из основных способов неспецифической защиты жизнеспособности органов и тканей является активность антиоксидантных систем, обеспечивающих устойчивость живых клеток к свободнорадикальному повреждению [15, 24]. Исследования последних лет подтвердили, что у женщин с ХВГП напряженность оксидантного стресса, регистрируемая по динамике плазменного уровня общей оксидантной активности, концентрации перекисных липидов и малонового диальдегида (МДА), прогрессивно нарастает к концу 3-го триместра беременности [3, 5, 33].
В АО различают ферментативные (оксидоредуктазные ферменты и антиперекисные ферменты) и неферментативные (низкомолекулярные тиолы, аскорбиновая кислота, токоферол, витамины А, К, Р, убихинон и др.) звенья. Защита структурных биологических мембран осуществляется преимущественно липидными биоантиоксидантами. Активность антиоксидантного фермента глутатионпероксидазы в эритроцитах существенно не изменена как при физиологической беременности, так и при риске невынашивания в обоих критических сроках. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в ранних сроках беременности повышается значительно. Одновременно уровень токоферола и ретинола снижается в плазме и повышается в плацентарной ткани. [33]. Важными ферментами АОС являются каталаза и церулоплазмин. Церулоплазмин (ЦП) -- медьсодержащая оксидаза, относится к альфа-2-глобулиновой фракции плазмы крови человека. Особый интерес вызывают антиоксидантные, иммунорегулирующие, радиопротективные свойства. Благодаря своей высокой ферроксидазной активности ЦП предотвращает неферментативные реакции, дающие начало свободным радикалам и дальнейшему развитию ПОЛ. При физиологических условиях ЦП крови ингибирует ПОЛ на 50%. Подавление ПОЛ достигается за счет перехвата и инактивации супероксидного ион-радикала О2 * [3, 5].
Выявлено увеличение концентрации ЦП у беременных в сравнении с их значениями у небеременных [27, 34]. По-видимому, данный факт объясняется активацией системы ПОЛ при беременности, приводящей в свою очередь к активации антиоксидантной системы защиты организма. Кроме того, выявлено достоверное снижение активности ЦП при ХВГП и гестозах, что может быть объяснено истощением антиоксидантной системы защиты организма в условиях ее напряженного функционирования, вызванного развитием тяжелых осложнений беременности [27, 29, 34, 44].
Каталаза -- фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий разложение перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. При низкой концентрации перекиси каталаза проявляет также пероксидазную активность, окисляя низшие спирты, полифенолы. Одной из основных функций каталазы является защита клеточных мембран от пероксида водорода, образующегося при перекисном окислении липидов [29].
Таким образом, при патологически протекающей беременности наблюдается дисбаланс в системе ПОЛ-АОС. При активации свободно-радикальных процессов на фоне снижения антиоксидантной активности риску повышенной окислительной модификации подвергаются не только липиды, но и белки. В связи с этим вызывает интерес изучение показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в плаценте при ХВГП.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы исследования
Активность катепсина D, содержание пептидов средней молекулярной массы, активность каталазы, церулоплазмина, уровень продуктов перекисного окисления липидов (диеновых и триеновых коньюгатов), уровень гидроперекисей определяли в плацентарной ткани, которую получили сразу после родов. Для исследования брали наиболее удаленную от места прикрепления пуповины ткань. Плацентарную ткань помещали в охлажденный физиологический раствор, очищали от крови и высушивали фильтровальной бумагой. Ткани взвешивали, навески гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком.
2.1.1. Клинические группы
Было обследовано 16 образцов плацентарной ткани женщин в возрасте от 20 до 40 лет.
Все родильницы были разделены на 2 группы (рис. 1). Первая группа - женщины с физиологическим течением беременности и родов (n =8), вторая группа - женщины с хронической внутриутробной гипоксией плода (n=8).
Клинические группы
20
норма ХВГП
Рис. 1. Клинические группы
2.2. Методы исследования
2.2.1. Метод определения активности катепсина D
Для определения активности катепсина D использовали 7,5%-ый гомогенат ткани на натрий-ацетатном буфере (рН 3,3). Препарат фермента (20 мкл) смешивали с 60 мкл 100 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 3,3) и преинкубировали 8 мин при температуре 37°С. Начинали реакцию прибавлением в опытные пробы 20 мкл 8% раствора гемоглобина, полученного из бычьей крови. Реакцию останавливали через 40 мин прибавлением 100 мкл 5% раствора трихлоруксусной кислоты. В контрольные пробы добавляли 20 мкл 8% раствора гемоглобина. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. После центрифугирования отбирали 100 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося тирозина методом Лоури. Пробы колориметрировали на КФК-2 при л=750 нм. Активность фермента определяли как разность в оптической плотности между опытными и контрольными пробами. Активность фермента выражали в нмоль тир, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Количество белка в пробах определяли методом Лоури.
2.2.2. Метод определения количества пептидов средней молекулярной массы
Для определения количества пептидов средней молекулярной массы использовали 5%-ый гомогенат ткани. Белки исследуемой биологической жидкости осаждали равным объемом 0,6 М раствора хлорной кислоты. Осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость нейтрализовали 3М раствором К2СО3 из расчета 0,2 мл на 1 мл супернатанта. Осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Нейтрализованный супернатант разводили в 5 раз. После центрифугирования отбирали 0,5 мл нейтрализованного разведенного супернатанта, в котором определяли количество пептидов средней молекулярной массы методом Лоури. Содержание пептидов средней молекулярной массы выражали в мкг/мл.
2.2.3. Метод определения активности каталазы
Активность каталазы выражается каталазным числом - количеством мг перекиси водорода, которое может разложить 1 мкг крови (гомогената).
В две колбы наливали по 7 мл дистиллированной воды и добавляли в них по 1 мл гомогената. Содержимое контрольной пробы кипятили 2 - 3 мин. В обе колбы вносили по 2 мл 1% раствора H2O2 и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем приливали по 5 мл 10% H2SO4 и оттитровывали содержимое колб 0,05н раствором KMnO4 до розового цвета.
Расчет: 1мл 0,05 н KMnO4 соответствует 0,85 г H2O2. Таким образом, разницу в результатах титрования контроля и опыта умножаем на эту величину и получаем количество мг перекиси водорода, которое может разложить 1 мкл гомогената.
2.2.4. Метод определения активности церулоплазмина
Активность церулоплазмина определяли модифицированным методом Ревина, который базируется на окислении p-фенилендиамина при участии этого фермента. Ферментативную реакцию останавливают добавлением фтористого натрия. По оптической плотности образующихся продуктов судят о концентрации церулоплазмина.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5
