После инкубации во все пробирки, за исключением контрольной, доливали по 2 мл раствора фтористого натрия. Содержимое пробирок перемешивали и переносили в холодильник, где выдерживали в течение 30 минут при +40С.
Пробы колориметрировали на КФК-2 при л=530 нм. Результаты сравнивали с данными контрольной пробы. Значение оптической плотности умножали на коэффициент пересчета 875.
2.2.5. Метод определения содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновых и триеновых коньюгатов)
Для экстракции липидов брали 1 мл 25% гомогената плацентарной ткани, приливали 3 мл метанола, перемешивали стеклянной палочкой, встряхивали в течение 15 минут, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут. Добавляли 3 мл гексана, вновь тщательно перемешивали стеклянной палочкой, встряхивали в течение 15 минут и оставляли отстаиваться на 30 минут.
После разделения слоев, верхний (метанол - гексановый слой) отбирали в сухую пробирку и использовали для исследований.
Уровень диеновых конъюгатов определяли спектрофотометрически при длине волны 233 нм, кетодиенов и сопряженных триенов - 278 нм, ненасыщенных липидов - 220 нм. Рассчитывали содержанимое диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов по отношению к уровню ненасыщенных липидов (E233/E220 и Е278/Е220).
2.2.6. Метод определения содержания гидроперекисей
Для приготовления гомогената использовали буфер 0,025 н трис-HCl (pH 7,4), содержащий 0,175 м KCl. В центрифужные пробирки помещали по 2 мл 25% гомогената и осаждали белки добавлением 0,2 мл 50% раствора ТХУ.
Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием в течении 10 минут при 4000 об/мин. Далее 2 мл надосадочной жидкости доводили 96% этанолом до 27 мл, прибавляли 0,2 мл концентрированной соляной кислоты и 0,025 мл 5%-го раствора соли Мора в 3%-ной HCl, пробы интенсивно встряхивали. Через 30 секунд приливали 1 мл 20%-го раствора роданистого калия, после чего развивается малиновая окраска. В качестве контроля использовали пробы, содержащие 96%-ный этанол вместо надосадочной жидкости. Измерение оптической плотности проводили в течение 10 минут после добавления роданистого калия при л=480 нм.
2.2.7. Статистическая обработка результатов исследования
Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента. Корреляционный анализ проводили с помощью программы Статистика (версия 6.0).
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Активность катепсина D в плацентарной ткани в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода
Результаты исследования показали достоверное повышение активности катепсина D плацентарной ткани при хронической внутриутробной гипоксии плода. Отмечено повышение активности фермента при патологии в 1,8 раз по сравнению с нормой (рис.2).
Рис.2. Активность катепсина D в плаценте в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 относительно нормы)
Повышение активности катепсина D плацентарной ткани при хронической внутриутробной гипоксии плода может быть связано с нарушением структурно-функциональных свойств клеточных мембран плаценты при изучаемой патологии.
3.2. Количество пептидов средней молекулярной массы в плацентарной ткани в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода
Согласно результатам исследования при хронической внутриутробной гипоксии плода содержание пептидов средней молекулярной массы в плацентарной ткани повышалось в 1,86 раза по отношению к норме (рис. 3).
Рис. 3. Содержание пептидов средней молекулярной массы в плаценте в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода (мкг/мл; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 относительно нормы)
Повышение содержания пептидов средней молекулярной массы может быть связано с повышением активности катепсина D [14].
3.3. Активность каталазы в плацентарной ткани в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода
Результаты исследования показали достоверное понижение активности каталазы в плацентарной ткани при хронической внутриутробной гипоксии плода в 1,46 раза по отношению к норме (рис. 4).
Рис. 4. Активность каталазы в плаценте в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода (каталазное число; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 относительно нормы)
3.4. Активность церулоплазмина в плацентарной ткани в норме
и при хронической внутриутробной гипоксии плода
Согласно результатам исследования при хронической внутриутробной гипоксии плода активность церулоплазмина в плацентарной ткани понижалась в 1,49 раза по отношению к норме (рис. 5).
Рис. 5. Активность церулоплазмина в плаценте в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода (единицы; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 относительно нормы)
Вероятно, снижение активности каталазы и церулоплазмина в плацентарной ткани при ХВГП связано с угнетением антиоксидантной системы [31].
3.5. Активность диеновых коньюгатов в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода в плацентарной ткани
Согласно результатам исследования при хронической внутриутробной гипоксии плода активность диеновых коньюгатов в плацентарной ткани понижалась в 1,6 раза по отношению к норме (рис. 6).
Рис. 6. Активность диеновых коньюгатов в плаценте в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода (единицы; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 относительно нормы)
3.6. Активность триеновых коньюгатов в плаценте в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода
Согласно результатам исследования при хронической внутриутробной гипоксии плода активность триеновых коньюгатов в плацентарной ткани понижалась в 2,1 раза по отношению к норме (рис. 7).
Рис. 7. Активность триеновых коньюгатов в плацентарной ткани в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода (единицы; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 относительно нормы)
Понижение содержания диеновых и триеновых конъюгатов может быть связано с усилением активности низкомолекулярных антиоксидантов - токоферола и ретинола, содержание которых повышено в плацентарной ткани при изучаемой патологии [6].
3.7. Концентрация гидроперекисей в плацентарной ткани в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода
Согласно результатам исследования при хронической внутриутробной гипоксии плода концентрация гидроперекисей в плацентарной ткани повышалась в 1,25 раза по отношению к норме (рис. 8).
Рис. 8. Концентрация гидроперекисей в плацентарной ткани в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода в плацентарной ткани (единицы; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 относительно нормы)
Повышение содержания гидроперекисей в плацентарной ткани при хронической внутриутробной гипоксии плода, скорее всего, является результатом усиления перекисного окисления липидов на фоне пониженной антиоксидантной активности.
Плацента - основной орган, осуществляющий анатомо-физиологическую связь между матерью и плодом и обеспечивающий гомеостаз в фетоплацентарном комплексе. Различные патологические состояния материнского организма приводят к нарушениям компенсаторно-приспособительных механизмов и, соответственно, к различным формам плацентарной недостаточности. Нарушение транспортной, трофической, эндокринной и метаболической функций плаценты является причиной таких патологий, как гипоксия, гипотрофия и внутриутробная задержка развития плода [46]. Длительное или повторное воздействие повреждающих факторов приводит к чрезмерной активации деятельности плаценты и напряжению всех компенсаторных механизмов. Напряжение в последующем сменяется стадией угнетения, которая характеризуется дезорганизацией основных функций и развитием необратимых деструктивных процессов в плаценте [4], что вызывает интерес к изучению активности катепсинов в данном органе при физиологическом и осложненном течении беременности [16, 38].
Результаты исследования показали достоверное повышение активности катепсина D в плацентарной ткани при ХВГП.
В патогенезе ХВГП одно из ведущих мест занимает нарушение структурно-функциональных свойств клеточных мембран плаценты. При патологическом течении беременности усиливается перекисное окисление липидов на фоне снижения антиоксидантной активности [4].
Согласно результатам исследования при ХВГП в плацентарной ткани отмечено достоверное уменьшение активности каталазы и церулоплазмина по сравнению с нормой. Вероятно, в условиях патологического течения беременности ферментативное звено антиоксидантной системы угнетается и накопливаются токсичные продукты перекисного окисления. Предполагается, что это оказывает влияние на активность фермента, так как обнаружена положительная корреляционная взаимосвязь (КК=0,89**) между активностями церулоплазмина, каталазы и катепсина D в плацентарной ткани.
Нарушения в системе ПОЛ и АОА являются одним из механизмов формирования антиоксидантной недостаточности вследствие чрезмерного усиления ПОЛ. В результате активации перекисного окисления липидов и накопления свободных радикалов происходит нарушение структурно-функциональной целостности клеточных мембран, в том числе и лизосомальных. Эти процессы приводят к выходу кислых гидролаз в цитозоль. В результате наблюдается усиление процессов аутолиза и дезорганизация практически всех сторон метаболизма. Неконтролируемое нарастание протеолиза вызывает инактивацию ферментов и пептидных гормонов, изменяет их функциональную роль [2, 3, 33].
Кроме того, выявлено достоверное снижение уровня диеновых и триеновых коньюгатов в плацентарной ткани при хронической внутриутробной гипоксии плода по сравнению с нормой.
Это может быть связано с повышением активности низкомолекулярных антиоксидантов (ретинола и токоферрола), содержание которых повышается в плацентарной ткани [6]. Учитывая положительные корреляционные взаимосвязи (КК=0,95**) уровня диеновых и триеновых коньюгатов с активностью катепсина D, увеличение антиоксидантной защиты можно расценивать как компенсаторно-приспособительную реакцию в условиях хронической внутриутробной гипоксии плода.
В развитии ХВГП важную роль играет дисфункция эндотелия сосудов фетоплацентарного комплекса. Последняя характеризуется снижением выработки эндотелием вазодилататоров, это вызывает спазм сосудов, нарушение микроциркуляции, в результате чего развиваются локальные ишемические изменения в плаценте. Данные процессы ведут к активации ПОЛ, образованию токсичных радикалов (гидроперекисей липидов, диеновых и триеновых коньюгатов). При этом снижена ферментативная антиоксидантная защита (уменьшение активности каталазы и церулоплазмина в плацентарной ткани). Все выше перечисленное способствует нарушению структурно-функциональных свойств клеточных мембран. Необходимо отметить, что согласно литературным данным [2, 3, 6], наблюдается активация звена антиоксидантной системы - токоферола и ретинола, которые, возможно, и способствуют снижению уровней диеновых и триеновых конъюгатов в плацентарной ткани.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5
