Биосинтез 2Н-меченого бактериородопсина галофильной бактерией Halobacterium halobium - рефераты, скачать рефераты, бесплатно рефераты

Рефераты. Биосинтез 2Н-меченого бактериородопсина галофильной бактерией Halobacterium halobium

2Н-Меченый БР (выход 8-10 мг с 1 грамма бактериальной биомассы) получали на синтетической среде, заменяя протонированные фенилаланин, тирозин и триптофан их дейтерированными аналогами L-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланином, L-[3, 5-2H2]тирозином и L-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофаном (г/л): D,L-аланин 0.43, L-аргинин 0.4, D,L-аспарагиновая кислота 0.45, L-цистеин 0.05, L-глутаминовая кислота 1.3, L-глицин 0.06, D,L-гистидин 0.3, DL-изолейцин 0.44, L-лейцин 0.8; L-лизин 0.85, D,L-метионин 0.37, DL-фенилаланин 0.26, L-пролин 0.05, D,L-серин 0.61, D,L-треонин 0.5, L-тирозин 0.2, D,L-триптофан 0.5, D,L-валин 1.0; АМФ 0.1, УМФ 0.1, NaCl 250, MgSO4 . 7H2O 20, KСl 2, NH4Cl 0.5, KNO3 0.1, KH2PO4 0.05, K2HPO4 0.05, Na+-цитрат 0.5, MnSO4 . 2H2O 3 x 10-4, CaCl2 . 6H2O 0.065, ZnSO4 . 7H2O 4 x 10-5, FeSO4 . 7H2O 5 x 10-4, CuSO4 . 5H2O 5 x 10-5, глицерин 1.0; биотин 1 x 10-4, фолиевая кислота 1.5 x 10-4, витамин В12 2 x 10-5. Среду автоклавировали 30 мин при 0.5 ати, рН доводили 0.5 М КОН до 6.5-6.7. Синтез проводили в колбах Эрленмейера, вместимостью 500 мл (объем реакционной смеси 100 мл) 3-4 сут при 35-370С в условиях интенсивной аэрации на орбитальном шейкере Biorad 380-S (Венгрия) и освещении монохромными лампами ЛДС-40 (3 x 1.5 лк).

Выделение фракции пурпурных мембран (ПМ). Биомассу (1 г) промывали дистиллированной водой и осаждали центрифугированием (1500 g, 20 мин). Осадок суспендировали в 100 мл дистиллированной воды и выдерживали 1 сут при 40С. Реакционную смесь центрифугировали (1500 g, 15 мин), осадок ресуспендировали в 20 мл дистиллированной воды и дезинтегрировали ультразвуком (22 кГц, 3 x 5 мин) в водяной бане со льдом (00С). Клеточный гомогенат после промывки дистиллированной водой суспендировали в 10 мл буфера 125 мМ NaCl, 20 мМ MgCl2, 4 мМ Трис-HCl, (рН 8.0), добавляли 5 мкг РНК-азы (2-3 ед. акт.) и инкубировали 2 ч при 370С. Затем добавляли 10 мл того же буфера, выдерживали 14-16 ч при 40С. Водную фракцию отделяли центрифугированием (1500 g, 20 мин), осадок ПМ обрабатывали 50% этанолом (5 x 7 мл) при -50С с последующим отделением растворителя. Процедуру повторяли трижды до получения бесцветных промывных вод. Содержание белка определяли спектрофотометрически по соотношению D280/D568 (280 1.1 x 105 и 568 6.3 x 104 M-1 см-1 [23]). Регенерацию ПМ проводили как описано в работе [24]. Выход фракции ПМ 120 мг (х. ч. 80-85%).

БР выделяли по методу Остерхельта [25], модифицированного нами [24], солюбилизируя фракцию ПМ (в Н2О) (1 мг/мл) в 1 мл 0.5% ДДС-Na, смесь инкубировали 7-9 ч при 370С с последующим центрифугированием (1200 g, 15 мин). Осадок отделяли, к супернатанту добавляли дробными порциями метанол (3 x 100 мкл) при 00С, выдерживали 14-15 ч при -50С и центрифугировали при охлаждении (1200 g, 15 мин). Фракционирование проводили трижды, уменьшая концентрацию 0.5% ДДС-Na до 0.2 и 0.1%. Кристаллический белок (8-10 мг) промывали холодной дистиллированной водой (2 x 1 мл) и центрифугировали (1200 g, 15 мин).

Очистку БР осуществляли методом гель-проникающей хроматографии на откалиброванной колонке с габаритными размерами 150 x 10 мм; неподвижная фаза Сефадекс G-200 (Pharmaсia, США) (удельный объем упакованных гранул 30-40 ед на 1 г сух. сефадекса) с ручным отбором проб. Колонку уравновешивали буферным раствором, содержащим 0.1% ДДС-Na и 2.5 мМ ЭТДА. Пробу белка растворяли в 100 мкл буферного раствора и элюировали 0.09 М Трис-боратным буфером, содержащим 0.5 М NaCl с pH 8.35 (I = 0.075) со скоростью 10 мл/см2 x ч. Объединенные белковые фракции подвергали лиофильной сушке, запаивали в стеклянные ампулы (10 x 50 мм) и хранили в темноте при -40С.

Гидролиз БР. 4 мг белка помещали в стеклянные ампулы размером 10 x 50 мм, добавляли 5 мл 4 н. Ba(OH)2 и выдерживали 24 ч при 1100С. Реакционную смесь суспендировали в 5 мл горячей дистиллированной воды и нейтрализовали 2 н. H2SO4 до рН 7.0. Выпавший осадок сульфата бария отделяли центрифугированием (200 g, 10 мин), супернатант удаляли при 10 мм рт. ст.

N-Днс-производные аминокислот. К 4 мг сухого гидролизата БR в 1 мл 2 NaHCO3 (рН 9-10) порциями при перемешивании добавляли 25.6 мг Днс-хлорида в 2 мл ацетона. Реакционную смесь выдерживали 1 ч при перемешивании при 400С, подкисляли 2 н. HCl до рН 3 и экстрагировали этилацетатом (3 x 5 мл). Объединенный экстракт промывали дистиллированной водой до рН 7.0 (2 x 1 мл), сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст. Выход 15.3 мг (78%).

Метиловые эфиры N-Днс-производных аминокислот. Для получения диазометана к 20 мл 40% КОН в 40 мл диэтилового эфира добавляли 3 г влажной -нитрозометилмочевины и перемешивали 15-20 мин на водяной бане со льдом. После окончания газовыделения эфирный слой отделяли, промывали дистиллированной водой до рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия и использовали для обработки N-Днс-производных аминокислот. Выход 17.4 мг (69%).

L-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланин. 40 г фенилаланина растворяли в 300 мл 85% 2Н2SО4 (в 2Н2О) и нагревали с обратным водяным холодильником при 50-600С при перемешивании 3 сут. По окончании реакционную смесь охлаждали, нейтрализовали 30% NH4OН до рН 5.5. Продукт экстрагировали этанолом. Выход 24 г (58.7%). Т пл. 271-273, []d25 4.47 (с 1-2, 5 М НСl). рKa 2.20 (СООН), 9.31 (NH2). Rf 0.6 (Г). УФ-спектр (0.1 М НCl): max нм ( М-1 см-1): 257.5 ( 195). 1Н-ЯМР: 3.25 (2H, H), 4.4 (1H, H), 7.2-7.4 (0.07Н), УД 90 ат.% 2Н. Масс-спектр (M)+ m/z (I, %): 165 (34), метиловый эфир N-Dns-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина: 417 (14), 418 (6).

L-[3, 5-2H2]тирозин. 100 г тирозина растворяли в 150 мл 3 М 2Н2SO4. Реакционную смесь нагревали 2 сут при 40-500С с обратным водяным холодильником в токе азота. По окончании нейтрализовали 28% NH4OH до рН 4.5 и охлаждали 1 сут при 40С. Кристаллический продукт фильтровали, промывали 2Н2О и сушили при 10 мм рт ст. Выход 90 г (86.5%). Т пл. 316 - 317, []d25 10.0 (с 2, 5 М НСl). рKa 2.20 (СООН), 9.21 (NH2). Rf 0.45 (Г). УФ-спектр (0.1 М Нcl) max нм ( М-1 см-1): 223 ( 8200) и 274.5 ( 1340). 1Н-ЯМР: 3.32 (2H), 4.35 (1H), 6.9 (1H), 7.2 (2H), УД 96 ат.% 2Н. Масс-спектр (M)+ m/z (I, %): 181 (21), метиловый эфир N-Dns-[3, 5-H2]тирозина: 429 (15), 430 (5).

L-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофан. К 40 мл 100% 2Н2О добавляли при 40С и перемешивании 80 мл трифторуксусного ангидрида (0.5 моль) и выдерживали 2 ч при 40С, затем дробными порциями добавляли 25 г триптофана. Реакционную смесь выдерживали 3 сут в темноте при 220С, расстворитель удаляли при 10 мм рт., нейтрализовали 30% NH4OH до 5.9, охлаждали 1 сут при 40С. Кристаллический продукт фильтровали, промывали 2Н2О и сушили при 10 мм рт. ст. Выход 19 г (60.3%). Т пл. 283-285, []d25 2.8 (с 1-2, 1 М НСl). рKa 2.46 (СООН), 9.41 (NH2). Rf 0.5 (Г). УФ-спектр (0.1 М НCl) max нм ( М-1 см-1): 218 ( 33500), 278 нм ( 5550), 287.5 ( 4550). 1Н-ЯМР: 3.4 (2H, H), 4.4 (1H, H), 7.3 (1H, H), 7.2-7.4 (0.1Н, In-Н), УД 98 ат.% 2Н. Масс-спектр (M)+ m/z (I, %): 204 (28), метиловый эфир N-Dns-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана: 455 (9), 456 (11).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Oesterhelt D., Stoeckenius W. // Nature. 1971. V. 233. № 89. P.149-160

2. Spudich J. L. // Ann. Rev. Biophys. Chem. 1988. V. 17. № 12. P.193-215.

3. Karnaukhova E.N., Niessen W. M.A., Tjaden U.R. // Anal. Biochem. 1989. V. 181. № 3. P. 271-275

4. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1996. Т. 22. № 10-11. С. 856-869.

5. Mosin O.V., Karnaukhova E.N., Pshenichnikova A.B., Reshetova O.S. Electron impact mass-spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin / in: 6th Intern. Conf. on Retinal proteins. 1994. Leiden, the Netherlands, P. 115.

6. Hardy J. P., Knight A.E.W., Ghiggino K.P., Smith T.A., Rogers P.J. // Photochem. Photobiol. 1984. V. 39. № 1. P. 81-88.

7. Rosenbach V., Goldberg R., Gilon C., Ottolenghi M. // Photochem. Photobiol. 1982. V. 36. № 6. P. 197-201.

8. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. // Биотехнология. 1996. № 10. С. 24-40.

9. Первушин К.В., Арсеньев А.С. // Биоорган. химия. 1995. Т. 21. № 10. С. 83-111.

10. Звонкова Е.Н., Зотчик Н.В., Филлипович Е.И., Митрофанова Т.К., Мягкова Г.И., Серебренникова Г.А. Химия биологически активных природных соединений. М.: Химия, 1970. С. 65-68.

11. Muramoto K., Sunahara S., Kamiya H. // Agric. Biol. Chem. 1987. V. 51. № 6. P. 1607-1616.

12. Matsubara H., Sasaki R.M. // Biochim. Biophys. Res. Com. 1969. V. 35. № 10. P. 175-177.

13. Ng L.T., Pascaud A., Pascaud M. // Anal. Biochem. 1987. V. 167. № 2. P. 47-52.

14. Liu T.Y., Chang Y.H. // J. Biol. Chem. 1971. V. 246. № 2. P. 2842-2848.

15. Simpson R.J., Neuberger M.R., Liu T.Y. // J. Biol. Chem. 1976. V. 251. № 3. P. 1936-1938.

16. Пшеничникова А.Б., Карнаухова Е.Н., Звонкова Е.Н., Швец В.И. // Биоорганическая химия. 1995. Т. 21. № 3. С. 163-178.

17. Cohen J.S., Putter I. // Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 222. № 1. P. 515-520.

18. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. // Biosc. biotechnol. biochem. 1998. V. 62. № 2. P. 225-229.

19. Егорова Т.А., Мосин О.В., Еремин С.В., Карнаухова Е.Н., Звонкова Е.Н., Швец В.И. // Биотехнология. 1993. № 8. С. 21-25.

20. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. // Приклад. биохим. микробиол. 1999. Т. 35. № 1. С. 34-42.

21. Griffiths D.V., Feeney J., Roberts G.C., Burgen A.S. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 446. № 4. P. 479-585.

22. Matthews H.R., Matthews K.S, Opella S.J. // Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 497. № 23. P. 1-13.

23. Tokunada F., Ebrey T. // Biochemistry. 1978. V. 17. № 10. P. 1915-1922.

24. Мосин О.В., Егорова Т.А., Чеботаев Д.В., Складнев Д.А., Юркевич А.М., Швец В.И. // Биотехнология. 1996. № 4. С. 27-35.

25. Oesterhelt D., Hess B. // Eur. J. Biochem. 1973. V. 37. № 1. P. 316-326

BIOSYNTHESIS OF 2H-LABELED BACTERIORHODOPSIN BY HALOPHILIC BACTERIUM Halobacterium halobium

O. V. МOSIN

* Moscow State Academy of Fine Chemical Technology named after M.V. Lomonosov, 117571, Moscow, Vernadskogo prosp., 86;

The biosynthesis of 2H-labeled membrain protein bacteriorhodopsin by halophilic bacterium Halobacterium halobium, labeled with deuterium on residues of [2, 3, 4, 5, 6-2H5]phenylalanine, [3, 5-2H2]tyrosine, and [2, 4, 5, 6, 7-2H5]tryptophan was carried out. The combination of preparative and analitic methods including elecrtophoresis in 12.5% PAAG with 0.1% SDS-Na, gel filtration chromatography on Sephadex G-200, reverse-phase HCLP, 1Н NMR spectroscopy, and electron impact mass-spectrometry of methyl esters of N-Dns-derivatives of amino acids was used to prove the homogenity of the synthesized product, and the selectivity of the introduction of deuterium into the molecule.

Страницы: 1, 2, 3