Курсовая работа
Центрифугирование
1. Принцип метода
Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле. Суспензию частиц, помещенную в пробирку, загружают в ротор, установленный на валу привода центрифуги.
В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью. Скорость седиментации зависит от центробежного ускорения, прямо пропорционального угловой скорости ротора и расстоянию между частицей и осью вращения:
а центробежное ускорение тогда будет равно)
Поскольку один оборот ротора составляет 2п радиан, угловую скорость ротора в оборотах в минуту можно записать так:
Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g и называется относительное центробежное ускорение, т. е.
или
При перечислении условий разделения частиц указывают скорость вращения и радиус ротора, а также время центрифугирования. Центробежное ускорение обычно выражают в единицах g, рассчитанных из среднего радиуса вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке. На основании уравнения Доулом и Котциасом была составлена номограмма, выражающая зависимость ОЦУ от скорости вращения ротора и радиуса г.
Скорость седиментации сферических частиц зависит не только от центробежного ускорения, но и от плотности и радиуса самих частиц и от вязкости среды суспендирования. Время, необходимое для осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жидкости до дна центрифужной пробирки, обратно пропорционально скорости седиментации и определяется следующим уравнением:
где t -- время седиментации в секундах, rj -- вязкость среды, гч-- радиус частицы, рч-- плотность частицы, р -- плотность среды, гм-- расстояние от оси вращения до мениска жидкости, гд-- расстояние от оси вращения до дна пробирки.
Как следует из уравнения, при заданной скорости вращения ротора время, необходимое для осаждения гомогенных сферических частиц, обратно пропорционально квадрату их радиусов и разности плотностей частиц и среды и прямо пропорционально вязкости среды. Поэтому смесь гетерогенных, приблизительно сферических частиц, различающихся по плотности и размерам, можно разделить либо за счет разного времени осаждения их на дно пробирки при данном ускорении, либо за счет распределения седиментирующих частиц вдоль пробирки, устанавливающегося через определенный промежуток времени. При разделении веществ необходимо учитывать и такие важные факторы, как плотность и вязкость среды. Описанными методами можно разделять клеточные органеллы из гомогенатов тканей. Основные компоненты клетки осаждаются в следующей последовательности: сначала целые клетки и их фрагменты, затем ядра, хлоропласты, митохондрии, лизосомы, микросомы и, наконец, рибосомы. Осаждение несферических частиц не подчиняется уравнению, поэтому частицы одинаковой массы, но различной формы осаждаются при разных скоростях. Эта особенность используется при исследовании с помощью ультрацентрифугирования конформации макромолекул.
Препаративное центрифугирование заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследований. При этом можно брать большие количества исходного биологического материала, например посевы микробных клеток из периодических или непрерывных культур, а также посевы растительных и животных клеток из культур ткани и плазмы крови. С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности. Метод применяется также для выделения таких биологических макромолекул, как ДНК и белки из предварительно очищенных препаратов.
Аналитическое центрифугирование применяется главным образом для изучения чистых или практически чистых препаратов макромолекул или частиц, например рибосом. В данном случае используется небольшое количество материала, а седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярном весе и структуре материала. В практикумах для студентов препаративное центрифугирование применяется гораздо чаще, чем аналитическое, поэтому мы остановимся на нем более подробно, хотя в основе обоих методов лежат общие принципы.
2. Препаративное центрифугирование
2.1 Дифференциальное центрифугирование
Этот метод основан на различиях в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал, например гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. К сожалению, получить абсолютно чистый осадок практически невозможно; чтобы понять, почему это происходит, обратимся к рассмотрению процесса, происходящего в центрифужной пробирке в начале каждой стадии центрифугирования.
Сначала все частицы гомогената распределены по объему центрифужной пробирки равномерно, поэтому получить чистые препараты осадков самых тяжелых частиц за один цикл центрифугирования невозможно: первый образовавшийся осадок содержит в основном самые тяжелые частицы, но, кроме этого, также некоторое количество всех исходных компонентов. Получить достаточно чистый препарат тяжелых частиц можно лишь при повторном суспендировании и центрифугировании исходного осадка. Дальнейшее центрифугирование супернатанта при последующем увеличении центробежного ускорения приводит к седиментации частиц средних размеров и плотности, а затем и к осаждению самых мелких частиц, имеющих наименьшую плотность. На рис. 2.3 изображена схема фракционирования гомогената печени крысы.
Дифференциальное центрифугирование является, по-видимому, самым распространенным методом выделения клеточных органелл из гомогенатов тканей. Наиболее успешно применяется этот метод для разделения таких клеточных органелл, которые значительно отличаются друг от друга по размерам и плотности. Но даже и в этом случае получаемые фракции никогда не бывают абсолютно гомогенными, и для их дальнейшего разделения применяют другие методы, описанные ниже. Эти методы, основанные на различиях в плотности органелл, обеспечивают более эффективное разделение благодаря тому, что центрифугирование осуществляют в растворах с непрерывным или ступенчатым градиентом плотности. Недостатком этих методов является то, что приходится тратить время на получение градиента плотности раствора.
2.2 Зонально-скоростное центрифугирование
Метод зонально-скоростного, или, как его еще называют, s-зонального центрифугирования, заключается в наслаивании исследуемого образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности. Затем образец центрифугируют до тех пор, пока частицы не распределятся вдоль градиента в виде дискретных зон или полос. Благодаря созданию градиента плотности удается избежать смешивания зон, возникающего в результате конвекции. Метод зонально-скоростного центрифугирования применяется для разделения гибридов РНК--ДНК, субъединиц рибосом и других клеточных компонентов.
2.3 Изопикническое центрифугирование
Изопикническое центрифугирование проводят как в градиенте плотности, так и обычным путем. Если центрифугирование проводится не в градиенте плотности, препарат сначала центрифугируют так, чтобы осели частицы, молекулярный вес которых больше, чем у исследуемых частиц. Эти тяжелые частицы отбрасывают, и образец суспендируют в среде, плотность которой такая же, как и у фракции, которую хотят выделить, а затем центрифугируют до тех пор, пока исследуемые частицы не осядут на дно пробирки, а частицы меньшей плотности не всплывут на поверхность жидкости..
Другой способ заключается в наслаивании образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности, охватывающим диапазон плотностей всех компонентов смеси. Центрифугирование проводят до тех пор, пока плавучая плотность частиц не сравняется с плотностью соответствующих зон, т. е. пока не произойдет разделение частиц по зонам. Метод получил название зонально-изопикнического, или резонального центрифугирования, так как основным моментом здесь является плавучая плотность, а не размеры или форма частиц. На величину плотности, при которой частицы образуют изопикнические полосы, влияет природа среды суспендирования; частицы могут быть проницаемыми для одних соединений, находящихся в растворе, и непроницаемыми для других или же присоединять молекулы раствора. При использовании зонального ротора митохондрии, лизосомы, пероксисомы и микросомы концентрируются в полосах с 42%, 47%, 47% и 27%-ной сахарозой, соответствующих плотности 1,18, 1,21, 1,21 и 1,10 г-см-3 соответственно. Плотность субклеточных органелл зависит также и от избирательного поглощения ими определенных соединений. Введение крысам не вызывающего гемолиз детергента тритона WR-1339 приводит ^увеличению размеров и уменьшению плотности лизосом печени; плотность митохондрий и пероксисом остается без изменений. Несмотря на то что седиментационные свойства лизосом при этом, как правило, не меняются, их равновесная плотность в градиенте сахарозы понижается с 1,21 до 1,1, что приводит к соответствующему разделению лизосомально-пероксисомальной фракции. Эта особенность используется при количественном разделении лизосом, митохондрий и пероксисом, основанном на удалении из гомогенной среды всех частиц с большей, чем у микросом, плотностью и последующем изопикническом центрифугировании выпавших в осадок тяжелых частиц.
2.4 Равновесное центрифугирование в градиенте плотности
Для создания градиента плотности используют соли тяжелых металлов, например рубидия или цезия, а также растворы сахарозы. Образец, например, ДНК, смешивают с концентрированным раствором хлористого цезия. И растворенное вещество, и растворитель сначала распределяются по всему объему равномерно. В ходе центрифугирования устанавливается равновесное распределение концентрации, а следовательно, и плотности CsCl, так как ионы цезия обладают большой массой. Под действием центробежного ускорения молекулы ДНК перераспределяются, собираясь в виде отдельной зоны в части пробирки с соответствующей им плотностью. Метод применяется главным образом в аналитическом центрифугировании и был использован Мезельсоном и Сталем для изучения механизма репликации ДНК Е. coli. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является также одним из методов разделения и изучения липопротеидов плазмы крови человека.
2.5 Формирование и извлечение градиентов
2.5.1 Природа градиентов
Для создания градиентов плотности растворов чаще всего применяются растворы сахарозы, иногда с фиксированным рН. В некоторых случаях хорошее разделение получается при использовании вместо обычной воды D20. В табл. 2.1 приведены свойства некоторых растворов сахарозы.
Выбор градиента диктуется конкретными задачами фракционирования. Так, например, фикол, выпускаемый фирмой Pharmacia Fine Chemicals, может заменять сахарозу в тех случаях, когда необходимо создать градиенты с большой плотностью и низким осмотическим давлением. Еще одно преимущество фикола состоит в том, что он не проходит через клеточные мембраны. Для создания градиентов большей плотности применяют соли тяжелых металлов, например рубидия и цезия, однако из-за коррозирующего действия CsCl такие градиенты используются только в роторах, изготовленных из стойких металлов, например титана»
Страницы: 1, 2, 3
