21
«Работа допущена к защите»:
Список сокращений
Введение
Глава 1. Галофильные микроорганизмы
1.1 Осмоадаптация
1.2 Гиперосмотический шок
1.3 Спектр совместимых растворимых веществи их распространение у микроорганизмов
Глава 2. Биосинтез эктоина и гидроксиэктоина
2.1 Гены и ферменты биосинтеза эктоина и гидроксиэктоина
Глава 3. Осмоадаптация аэробных метилотрофных бактерий. Экспериментальная часть
Глава 4. Материалы и методы исследования
4.1 Культивирование бактерий
4.2 Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка
4.3 Определение активности диаминобутиратацетилтрансферазы.
4.4 Выделение и анализ осмопротекторов
4.5 Молекулярно-биологические методы
4.6 Определение и анализ последовательностей нуклеотидов
4.7 Клонирование и экспрессия генов
4.8 Выделение и очистка белков
4.9 Определение физико-химических свойств ферментов
Результаты и обсуждение
Глава 5. Идентификация и характеристика генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina
5.1 Накопление эктоина у M. marina
5 2 Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у M.marina
5.3 Интеграция генов биосинтеза эктоина из M. marina в негалофильный штамм Methylobacterium extorquens AM1
Глава 6. Характеристика рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы
6.1 Клонирование, очистка и первичная характеристика рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы
Выводы
Список литературы
ask - ген, кодирующий аспартаткиназу (Ask)
ectA - ген, кодирующий ДАБ-ацетилтрансферазу (EctA)
ectB - ген, кодирующий ДАБ-аминотрансферазу (EctB)
ectC - ген, кодирующий эктоинсинтазу (EctC)
ectD - ген, кодирующий эктоингидроксилазу (EctD)
His - гистидин
Ni2+-NTA - Ni2+- нитроацетат агароза
SDS - додецилсульфат натрия
АТФ - аденозин-5'-трифосфат
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ДАБ - диаминобутират
ДАБАцТ - ДАБ-ацетилтрансфераза
ДТНБ - 5,5'-дитиобис-(2-нитробензоат)
ДТТ - 1,4-дитиотриетол
ИПТГ - изопропил-1-тио-в-D-галактопиранозид
КоА - коэнзим А
НАД(Ф)+ - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат), оксиленный
НАД(Ф)Н - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат), восстановленный
ОРС - открытая рамка считывания
п.н. - пары нуклеотидов
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
Трис-НСl - трис(гидроксиметил)аминометанхлорид
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ФЕП - фосфоенолпируват
ФМС - феназинметосульфат
ФМСФ - фенилметансульфонилфторид
Х-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-в-D-галактозид
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
Актуальность проблемы. Микроорганизмы, существующие в условиях высокой солености, для поддержания осмотического равновесия между клеткой и внешней средой накапливают в клетках неорганические ионы или низкомолекулярные органические соединения - осмолиты или осмопротекторы. Стратегию осмоадаптации, связанную с аккумуляцией органических осмопротекторов - веществ, совместимых с основными метаболическими процессами в клетках, реализуют многие умеренно галофильные прокариоты. Среди них недавно обнаружены аэробные метилотрофные бактерии, выделенные из (гипер)соленых и щелочных водоемов (Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001; Doronina et al., 2003), использующие в качестве источников углерода и энергии метан (метанотрофы) или его окисленные и замещенные производные (метилобактерии). Установлено, что аэробные галофильные метилотрофы накапливают циклическую иминокислоту эктоин (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат), глутамат и сахарозу (Khmelenina et al., 1999).
Биосинтез эктоина, широко распространенного в микробном мире осмопротектора, у гетеротрофных галофильных бактерий начинается реакцией трансаминирования L-аспартилполуальдегида с последующим ацетилированием образующегося L-2,4-диаминобутирата (ДАБ) и завершается циклизацией N-ацетил-L-2,4-ДАБ в эктоин (Galinski, 1995). В последние годы предпринимаются попытки детального изучения свойств ферментов и генов этого биохимического пути, что обусловлено практическими задачами получения эктоина, перспективного биопротектора, используемого в медицине и косметике, а также в научной практике в качестве водоудерживающего средства и стабилизатора биомолекул и целых клеток.
Специфические ферменты, катализирующие реакции биосинтеза эктоина - ДАБ-ацетилтрансфераза (EctА), ДАБ-аминотрансфераза (EctB) и эктоинсинтаза (EctС), частично охарактеризованы у Halomonas elongata (Ono et al., 1999), а так же у метанотрофной бактерии Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (Reshetnikiov et. al., 2006). Гены, кодирующие эти ферменты, идентифицированы у ряда гетеротрофных, автотрофных галофильных прокариот и метилотрофных бактерий, установлено расположение данных генов в одном опероне ectABC. Однако соответствующие сведения о свойствах ферментов и организации генов биосинтеза эктоина у галотолерантной метилотрофной альфа-протеобактерии Methylarcula marina отсутствуют. В связи с вышеизложенным представлялось актуальным провести исследование ферментов и генов биосинтеза эктоина у M. marina для выявления степени сходства и/или возможных отличий от других бактерий.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной альфа-протеобактерии Methylarcula marina. Для достижения указанной цели были поставлены и решались следующие задачи:
Идентифицировать гены биосинтеза эктоина у M. marina, провести их филогенетический анализ.
Клонировать ген ectA, получить и охарактеризовать рекомбинантную ДАБ-ацетилтрансферазу.
Сконструировать плазмидную конструкцию, несущую ectABC гены под промотором метанолдегидрогеназы Pmax, для интеграции в хромосому негалофильной метилобактерии Methylobacterium еxtorquens AM1.
Измерить накопление эктоина в рекомбинантных клетках и в среде культивирования M. еxtorquens AM1.
Магистерская диссертация выполнена на базе ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, в лаборатории радиоактивных изотопов под руководством д.б.н., проф. Троценко Ю.А.
Научная новизна. Установлено, что в ответ на увеличение солености среды изучаемый галотолерантная метилотрофная бактерия накапливает в клетках эктоин. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina, относящейся к классу б-Proteobacteria. Показано, что у M. marina гены, кодирующие ДАБ-ацетилтрансферазу (ectA), ДАБ-аминотрансферазу (ectB), эктоинсинтазу (ectC) и аспартаткиназу (ask), сцеплены и составляют оперон ectABC-ask.
Клонированием и экспрессией в Escherichia coli гена ectA из M. marina впервые получен гомогенный и частично охарактеризован препарат рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы. Полученные результаты создают основу для изучения регуляции биосинтеза эктоина на биохимическом и генетическом уровнях у M. marina .
Практическое значение работы. Проведенное расшифровка нуклеотидных последовательностей и организации ect-генов позволяет рационально манипулировать данным генетическим материалом с целью создания более эффективных штаммов-продуцентов эктоина на основе метанола.
Глава 1 Галофильные микроорганизмы
Микроорганизмы обитают в водной среде с различной степенью солености, от пресных и морских биотопов до гиперсолёных водоёмов с высокими концентрациями NaCl, вплоть до насыщения. По отношению к солености микроорганизмы разделяются на несколько физиологических групп.
Негалофилные микрооганизмы, обитающие в пресных и ультрапресных экосистемах, не нуждаются в NaCl и способны существовать в местах с крайне низким содержанием солей (?0.01%). К ним относится также симбиотрофная микрофлора, связанная с организмом человека, животных и растений. Угнетение их роста начинается обычно при концентрации NaCl около 3%. Галотолерантные микрооганизмы выдерживают более высокие концентрации и часто обитают в местах с меняющейся соленостью, например, в почве. Слабые галофилы оптимально растут при солености около 3.5% и, как правило, развиваются в узком диапазоне концентраций соли (2.5-5% NaCl). К слабым галофилам относят большинство морских микроорганизмов. Умеренные галофилы лучше всего растут на средах, содержащих 5-15% соли. Микроорганизмы, способные к росту в присутствии менее чем 0.1 М соли, относятся к факультативным галофилам. Умеренные галофилы обычно нуждаются не только в ионах Na+, но также в K+ и Mg2+. Экстремальные галофилы оптимально растут на среде, содержащей от 12-15% NaCl вплоть до насыщенных растворов. Примером могут служить “красные галофилы” - галобактерии и галококки.
Особую группу составляют галоалкалофилы, растущие при высоких концентрациях соды и сочетающие в себе свойства галофилов и алкалофилов. Типичными местами их обитания являются высокоминерализованные содовые озера.
Галофильные и галотолерантные микроорганизмы находятся во всех трёх доменах жизни: Археи, Бактерии и Эукариоты (Oren, 1999).
Один из основных параметров всех экосистем - осмотический стресс. Вода свободно проникает через мембрану, и неадаптированные организмы быстро теряют воду в присутствии солей. Чистая вода имеет активность (бw) равную 1, а растворы солей имеют значение бw меньше 1 (бw - отношение давления водяного пара над раствором к давлению над дистиллированной водой при испарении). Обитатели ультрапресных вод развиваются при водном потенциале 1, для морской воды этот потенциал равен 0.98, для гиперсоленых озер 0.75. Среды с повышенным содержанием сахара (бw?0.61), благоприятны для развития ксерофильных организмов (грибы и дрожжи), в гиперсолёных местообитаниях, где доступность воды лимитируется высокими концентрациями солей, обычно NaCl, распространены, главным образом, прокариоты (Grant, 2004). Для своего существования клетки должны поддерживать тургор - равное или избыточное по отношению к окружающей среде осмотическое давление в цитоплазме.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9
