Cеквенирование ДНК проводилось на фирме “Силекс” (Москва) с помощью “Big Dye Terminator Ready Reaction Kit” (“Applied Biosystems”, США) на автоматическом ДНК секвенаторе “DNA Sequencer ABI PRISM 310” (“Applied Biosystems”, США), в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Использовали 0.3-0.5 мкг ПЦР-фрагмента и соответствующий праймер. Для определения полной последовательности нуклеотидов в ДНК фрагментах, длина которых превышала 1000 п.н., на основе полученных последовательностей конструировали новые праймеры. Эти праймеры использовали затем для реакций секвенирования.

Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотные, определение сайтов рестрикции и открытых рамок считывания осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00, пакета программ VectorNTI®Advance v.9.0, DNAStar v.4.04 и Clone Manager 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей осуществляли посредством программы ClustalX (v1.62b) (Thompson et al., 1997) и GeneDoc. Филогенетический анализ осуществляли с помощью пакета программ PHYLIP v.3.6, используя программы SEQBOOT, PROTPARS и CONSENSE (Felsenstein, 2004).

4.7 Клонирование и экспрессия гена ectA

Ген ectA, содержащий сайт для рестриктазы Nco при инициирующем кодоне и сайт на 3' конце фрагмента для HindIII, амплифицировали из геномной ДНК M. marina с использованием праймеров EctA(halN-N) и EctA(hal-C) (табл. 10). Фрагмент после обработки рестриктазами Nco и HindIII, содержащий ген ectA, лигировали в вектор pET28, с образованием вектора pETectA.

4.8 Выделение и очистка рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы

Клетки E. coli BL21(DE3), трансформированные плазмидой pETectA, выращивали в 0.5 л среды LB c Аmp (50 мкг/мл для pETectA) при 37 ?С до оптической плотности А600 = 0.6-0.7, добавляли Изопропил-в-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали при 25 °С в течение 3 ч. Белок выделяли из суперпродуцента E. coli, как описано в протоколах фирмы “Quaigen” (Германия) с небольшими изменениями. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл лизисного буфера (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 20 мМ имидазола, 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 10 мг/мл лизоцима) и разрушали ультразвуком (3?0.5 мин с минутными перерывами). Лизат клеток центрифугировали 30 мин при 14000 об/мин и 4 °С, супернатант наносили на колонку, содержащую Ni2+-нитроацетат агарозу (“Quiagen”), объемом 5 мл. После промывки буфером (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 60 мМ имидазол) связанный белок элюировали с колонки тем же буфером, содержащим 150 мМ имидазола. Белковый спектр отобранных фракций, объёмом 0.5 мл, идентифицировали методом SDS электрофореза по Лэммли. Фракция, содержащая целевой белок (EctA-His6-tag), объединяли, диализовали против 50 мМ Трис-НCl буфера, рН 8,0 (содержащий 50 мМ КCl для ДАБ-ацетилтрансферазы и концентрировали с помощью Microcon YM-10 (“Millipore”, США).

Гель-фильтрацию белка EctAhal1-His6, проводили на колонке c Ultrоgel AcA54 (1.5?90 см), уравновешенной буфером, содержащим 50 мМ Трис-НСl, pH 8.0, 0.2 M NaCl. Скорость элюции - 15 мл/ч. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор стандартных белков (“Sigma” и “Pharmacia”): ферритин (450 кДа), БСА (66 кДа), ОВА (45 кДа), ДНКаза (31 кДа), лизоцим (14 кДа), цитохром с (12 кДа). Выход белка определяли по поглощению при 280 нм на УФ-детекторе (“LINEAR UVIS 200”, США).

4.9 Определение физико-химических свойств ферментов

Определение рН- и температурных оптимумов ДАБ-ацетилтрансферазы.

При определении рН-оптимумов применяли буферные системы рН 6.0-9.0. Использовали следующие буферные растворы: 100 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6.0-8.0; 100 мМ Трис-HCl буфер, рН 7.0 -9.0. Температурные оптимумы определяли в интервале температур от 5 до 35 ?С с использованием термоконтроллера “Shimadzu UV-160” (Япония).

Таблица 3. Буферы и растворы, использованные в работе.

Таблица 4. Плазмиды, использованные в работе.

Таблица 5. Праймеры, использованные в работе.

Результаты и обсуждение

Глава 5 Идентификация и характеристика генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерий Methylarcula marina

5.1 Накопление эктоина галотолерантным метилотрофом Methylarcula marina

Метанольные экстракты клеток галотолерантного метилотрофа Methylarcula marina анализировали методом ВЭЖХ на содержание эктоина. При увеличении солености среды в клетках M. marina возрастает содержание эктоина, причем максимальное содержание эктоина наблюдали при 8% NaCl (рис. 4). Рост M. marina замедляется при концентрации выше 6% NaCl. Снижение уровня эктоина в клетках, растущих при солености выше 8%, по-видимому, связано с накоплением других осмолитов.

Рис 4. Накопление эктоина клетками M. marina в ответ на солевой стресс NaCl, %

Следовательно, у M. marina эктоин является осмопротектором, т.е. соединением, ответственным за поддержание осмотического баланса между цитоплазмой и внешней средой. Далее представляло интересс изучить организацию генов биосинтеза данного осмолита у метилобактерии.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9