б) концентрация этого иона внутри клетки сильно отличается от его концентрации в наружной среде;
в) потенциал возникает на мембране только за счет ее проницаемости для этого иона и потому равен нернстовскому потенциалу.
Пока данных, прямо подтверждающих истинность этих фундаментальных положений мембранной теории, не было, следствие из нее могло получить и получало в продолжавшемся споре другое толкование. Так, влияние температуры могло объясняться ускорением химических реакций пусть не в месте повреждения, а на поверхности мышцы; влияние калия на величину ПП также могло быть истолковано как его химическое взаимодействие с веществом клетки и т. п.
Наибольшим нападкам подвергалась основа основ теории -- само существование мембраны, которую никак не удавалось увидеть в самый сильный микроскоп. Возражения относились не только к качественной картине явлений: были созданы теории, которые объясняли ПП свойствами протоплазмы и предсказывали ту же линейную зависимость ПП от температуры.
Таким образом, установить, какая теория верна, с помощью косвенных экспериментов оказалось невозможным. А прямые экспериментальные доказательства мембранной теории были получены очень нескоро: они требовали исследований на клеточном уровне, а в то время клетка как таковая еще не стала объектом электрофизиологического эксперимента.
Доказательства мембранной теории. Что снаружи? Что внутри?
Из трех основных «действующих лиц» мембранной теории -- мембрана, наружная среда, внутренняя среда -- довольно хорошо была исследована лишь наружная среда, и не только потому, что она была наиболее доступной. Химическим составом среды, окружающей клетки организма, биологам уже давно пришлось заниматься вне всякой связи с мембранной теорией. При любых экспериментах на изолированных органах их нужно держать в специально подобранном растворе. Например,, сердце лягушки нельзя оставлять просто на воздухе -- оно высохнет и перестанет работать, но нельзя поместить его и в воду -- под действием осмоса клетки органа погибнут.
Естественно, подбор таких растворов был связан с исследованием состава крови, гемолимфы и т. д., поэтому этот состав и был довольно хорошо известен.
Поэтому важный для подтверждения мембранной теории солевой -- а значит и ионный -- состав таких внеклеточных жидкостей был хорошо известен. Оказалось, что «главный поставщик» ионов всех таких растворов -- обыкновенная поваренная соль. Предполагают, что в этом отражается происхождение животных, главные ионы морской воды -- тоже натрий и хлор.
Особенно интересно и очень существенно с точки зрения мембранной теории то, что хотя абсолютная концентрация солей в тканевой жидкости разных организмов в зависимости от условий их обитания сильно варьирует, но соотношение концентраций ионов натрия и калия в среде, окружающей клетки организма, примерно одинаково для всех животных -- от медузы до человека. Концентрация калия примерно в 50 раз меньше, чем натрия. Таким образом, у всех животных эта среда по существу представляет собой в большей или в меньшей мере разбавленную морскую воду.
Гораздо труднее было определить ионный состав внутриклеточного содержимого. Ученые пытались использовать для определения этого состава самые разные методы, о которых мы не будем вам подробно рассказывать, по все данные, полученные этими методами, были лишь приблизительными: клетки слишком малы, а между ними всегда имеется межклеточное вещество и жидкость. Кроме того, сторонникам мембранной теории надо было не просто показать наличие калия внутри клеток, а наличие именно свободных, несвязанных ионов калия. Эта проблема была, как уже не раз случалось, решена с помощью двух подходов: и разработкой новых методов измерения, и подбором подходящего объекта.
В 1936 г. английский специалист по головоногим моллюскам Дж. Юнг обнаружил у кальмаров нервное волокно, диаметр которого доходил до миллиметра, т. е. по клеточным масштабам гигантское, хотя сам моллюск вовсе не был гигантским. Такое волокно, выделенное из организма и помещенное в морскую воду, не погибало. Наконец-то появилась живая клетка, в которую можно было проникнуть, с которой можно было работать.
В 1939 г. английские ученые А. Ходжкин и его ученик А. Хаксли впервые измерили разность потенциалов на мембране животной клетки. Удалось также доказать, что внутри этого волокна действительно много ионов калия, что эти ионы представляют собой «ионный газ», т. е. могут участвовать в создании мембранного потенциала. При этом расчетное значение ПП неплохо совпадало с непосредственно измеренным.
Распространить эти данные с уникальной клетки -- гигантского аксона -- на обычные клетки стало возможным, когда в 1946 г. американские ученые Джерард и Линг разработали новую методику -- методику микроэлектродов. Микроэлектрод -- это вытянутая иэ нагретой стеклянной трубочки тоненькая пипетка с диаметром кончика менее 1 мкм, заполненная раствором электролита.
Стекло играет роль изолятора, а электролит -- проводника. Такой электрод можно ввести в любую клетку, практически ее не повреждая.
Новая техника эксперимента быстро получила широкое распространение в самых разных исследованиях и за несколько лет буквально завоевала мир. Сам Джерард в США зарегистрировал ПП мышцы лягушки, сокращение которой наблюдал Гальвани и токи повреждения, в которой изучал Дюбуа-Реймон. Дж. Экклс в Новой Зеландии зарегистрировал ПП клетки мозга, Б. Катц в Англии начал изучать с помощью новых электродов действие нерва на мышцу; в Швейцарии С. Вайдман первым сумел ввести хрупкий микроэлектрод в сокращающееся сердце. В нашей стране пионером микроэлектродных исследований стал сотрудник Киевского государственного университета Платон Григорьевич Костюк, который начал применять эту технику в середине 50-х годов.
Вскоре были получены достаточно полные данные о величине ПП для разных клеток, ПП был обнаружен не только у мышечных и нервных клеток, но и у эритроцитов, клеток кожи, печени и др. Если считать, что причиной ПП служит разность концентраций ионов калия во внутренней и наружной средах клеток, разделенных мембраной, а все клетки в этом отношении устроены в общем сходно, то наличие ПП совершенно закономерно, хотя и не ясно, зачем понадобился ПП, например, клеткам слюнной железы или печени.
О пользе бракованных микроэлектродов
Теперь, когда достаточно точное измерение ПП в отдельной клетке не представляло проблемы для проверки мембранной теории по формуле Нернста, оставалось сделать последний шаг -- научиться так же точно определять ионный состав в клетке. И замечательно, что развитие микроэлектродной техники помогло решить и эту задачу.
Дело в том, что изготовление микроэлектродов -- это целое искусство: и стекло подобрать, чтобы хорошо тянулось, и режим нагрева и скорость вытягивания, чтобы копчик не обламывался и внутренний канал не закупоривал, и т. д. и т. п. И вдруг оказалось, что даже если в опыте использовался плохой, «бракованный» электрод, у которого на кончике вообще не было отверстия, потенциал все равно регистрировался, как будто стекло было не изолятором, а проводником. Когда стали в этом разбираться, оказалось, что, действительно, тоненькие стенки микроэлектродов из некоторых сортов стекла представляют собой -- что бы вы думали? -- полупроницаемую мембрану, т. е. избирательно пропускают ионы какого-либо сорта.
Если такой электрод, заполненный раствором с известной концентрацией изучаемого иона, опустить в раствор, содержащий тот же ион, то, зная значение возникшего нернстовского потенциала, можно использовать формулу Нернста для решения обратной задачи -- определить неизвестную концентрацию иона в исследуемом растворе.
Использование таких электродов в сочетании с методом меченых атомов и другими методами позволило определить ионный состав внутриклеточного содержимого. Оказалось, что, как и предсказывала мембранная теория, внутри клеток концентрация ионов калия в 30--40 раз выше, чем в наружной среде. Оказалось также, что соотношение калия и натрия внутри клеток животных совершенно иное, чем вне их: в то время как вне клетки много натрия, в клетках, наоборот, калия почти в 10 раз больше, чем натрия.
Высокое содержание ионов калия было обнаружено не только в нервных, но и в разных других клетках организма. Таким образом, внутреннее содержимое всех клеток животных оказалось непохожим на морскую воду. В ходе эволюции эти клетки создали свою особую внутреннюю среду.
Клеточная мембрана
Итак, вопросы об ионном составе внутренней и внешней среды, а также о величине ПП были решены; это косвенно доказывало и существование мембраны.
Увидеть мембрану удалось лишь в середине 50-х годов нашего века. Это было сделано с помощью электронного микроскопа, так как толщина мембраны составляет всего 7 --15 нм и в световой микроскоп ее увидеть нельзя. Однако еще до того, как ее непосредственно увидели, сомнения в ее существовании практически исчезли; многочисленные исследования, опирающиеся на факты из разных областей, свидетельствовали, что мембрана существует; более того, к этому времени было известно достаточно много об ее устройстве и свойствах: толщине, электрическом сопротивлении и т. д.
Обычно, говоря о научных предсказанниях, рассказывают об открытии «на кончике пера» планеты Нептун, или о предсказании существования атомов и молекул, или о предсказании Менделеевым химических элементов, которые заполнили оставшиеся пустыми соответствующие клетки его таблицы. Но и в биологии можно найти немало примеров таких научных предсказаний. Например, Гарвей, создавая теорию кровообращения, предсказал существование капилляров, но увидеть их смог только М. Мальпиги после изобретения микроскопа. Точно так же клеточная мембрана была предсказана задолго до появления электронного микроскопа.
Очень много сведений о свойствах мембраны дало изучение проникновения разных веществ в клетку. Это особый, весьма увлекательный и весьма запутанный рассказ, который мы не можем тут привести. Но общий вывод из него весьма поучителен. Дело в том, что, как сейчас выяснено, разные вещества попадают в клетку разными способами: одни, растворяясь в жирах мембраны, проникают в клетку прямо через них, другие вещества, которые не могут проходить через жиры, проникают через особые «поры», образованные мембранными белками, третьи -- совсем иначе, например, «заглатываясь» клеткой, в которой образуется отшнуровывающийся и уходящий внутрь мембранный пузырек; и это еще не все способы. Между тем ученые стараются объяснить некоторое явление с единой точки зрения. Для науки идеалом является, например, теория Максвелла, которая позволила связать воедино электрические, магнитные и оптические явления, описав их основные свойства несколькими уравнениями. Такую же единую теорию искали и ученые, изучавшие клеточную проницаемость. Однако, как мы теперь понимаем, в случае клеточной проницаемости такой единой теории просто не существовало. При наличии многих принципиально различных способов проникновения веществ в клетку для каждой теории, претендующей на полное объяснение фактов с единой точки зрения, находился опровергающий ее эксперимент. Мы все сталкивались с аналогичной ситуацией; вспомните, как Вольта пытался объяснить с единой точки зрения и контактную разность потенциалов, и работу химических элементов. Так, естественное стремление ученого к созданию единой теории иногда играет роль тормоза в развитии науки. Но вернемся к мембране.
Поверхность всякого организма играет особую роль, так как это -- место соприкосновения организма и среды. Именно на поверхности находится защитный слой; на поверхности находятся органы чувств; через поверхность организм получает воду, пищу и кислород. Все эти соображения применимы и к отдельной клетке. Через поверхностную мембрану клетка получает разные вещества, через нее же выводятся наружу продукты обмена. В мембрану встроены особые белки-рецепторы -- «органы чувств» клетки. Но мембрана покрывает не только поверхность клетки, внутри клетки тоже имеется множество мембран, которые делят клетку на отсеки, окружают ее органеллы. Особой двухслойной ядерной мембраной окружено ядро клетки, свою мембрану имеют «энергетические станции клетки» -- митохондрии. В пузырьках из мембран -- лизосомах -- хранятся некоторые клеточные ферменты и т. д.
Про мембраны теперь известно так много, что возникла особая наука -- мембранология; в нашей стране выходит специальный журнал «Биологические мембраны», а за рубежом журнал «Биология мембран». Для подробного рассказа о мембранах нужно было бы написать отдельную книгу. Такие книги уже написаны, поэтому мы расскажем здесь о мембранах лишь то, что будет нам совершенно необходимо для дальнейшего.
Клеточная мембрана представляет собой жидкую пленку, образованную жироподобными веществами -- липидами. Она состоит из двух слоев липидных молекул, в которые встроены молекулы белка.
Нас, прежде всего, будут интересовать, конечно, электрические характеристики мембраны, которые были определены с помощью самых разных методов. Эта работа была начата еще в 1910 г. в лаборатории Нернста и в ней принимал участие тот самый Гебер, который открыл влияние солей калия на потенциал мышц. Измерения проводились на суспензии клеток. Основной метод измерения состоял в том, что через суспензию пропускали ток разной частоты и определяли ее удельное сопротивление. Была развита теория, которая позволяла отдельно определить сопротивления мембраны клетки и ее протоплазмы, так как их отношение зависело от частоты пропускаемого тока.
Развивая это направление, Г. Фрикке в 1925 г. показал, что мембрана ведет себя в опытах как параллельно соединенные сопротивление и емкость, т. е., как говорят, выяснил эквивалентную схему мембраны. Схема эта первоначально была установлена Для мембраны эритроцитов; Фрикке использовал при измерениях частоты до 4,5 МГц, так что успеху его работы способствовало развитие физических приборов -- появление генераторов высокой частоты. В дальнейшем на самых разных клетках удалось измерить сопротивление мембраны, ее емкость, а также удельное сопротивление протоплазмы. Г. Фрикке и Г. Кертис работали с эритроцитами, лейкоцитами, одноклеточной водорослью -- хлореллой, дрожжами; К. Кол работал с яйцеклетками иглокожих, мышечными и нервными клетками.
Оказалось, что удельная емкость мембраны у всех изученных клеток составляет примерно 1 мкФ/см2. Не слишком сильно отличается у разных клеток и удельное сопротивление протоплазмы, оно обычно близко к 100 Ом-см, т. е. примерно такое же, как у морской воды. Напротив, удельное сопротивление мембраны у разных клеток оказалось весьма разным! Так, например, у яйцеклеток морского ежа удельное сопротивление мембраны составляет всего 100 Ом-см2, а у водоросли нигеллы -- 100 000 Ом-см2 *).
Почему же у разных клеток мембрана имеет одинаковую удельную емкость и столь разное удельное сопротивление? Дело в том, что емкость мембраны определяется ее липидным слоем, который можно рассматривать как диэлектрик, находящийся между двумя пластинами конденсатора.
А вот сопротивление мембраны определяется не липидами, а теми молекулами белка, которые встроены в жидкий липидный слой и плавают в нем, как айсберги, «прошивая» мембрану насквозь. Эти молекулы в разных клетках отличаются и по числу, и по свойствам -- отсюда и разное удельное сопротивление. Если убрать из липидного бислоя белок, то удельное сопротивление такой «чистой» мембраны оказывается весьма высоким -- порядка 108 Ом-см2.
С помощью изотопных и других методов было показано, что клеточная мембрана действительно является полупроницаемой: она хорошо пропускает положительные ионы калия, но не пропускает клеточные анионы. Но вернемся к мембранной теории.
Опыты на «голой» мембране -- торжество мембранной теории
В 1961 г. А. Ходжкин и его сотрудники Бекер и Шоу поставили очень красивый опыт. Еще когда Юнг открыл гигантский аксон у кальмара, он заметил, что при надавливании на такой перерезанный аксон его содержимое выдавливается из него, как паста из тюбика, и остается пустая «шкурка». Вот с этой оболочкой, т. е. мембраной аксона, и начали работать Ходжкин и его сотрудники. Они брали аксон, клали его на резиновую подложку, чтобы не повредить, и с помощью резинового ролика выдавливали из него протоплазму. Получалась пустая трубка из одной мембраны. Эту трубку через пипетку, вставленную в торец, можно было заполнять разными растворами. Таким образом, появилась возможность работать на мембране нервного волокна, меняя произвольно концентрацию веществ как снаружи, так и внутри аксона.
Оказалось, что при заполнении аксона растворами, содержащими такую же концентрацию К+, как и протоплазма, в аксоне возникал нормальный потенциал покоя порядка 50--60 мВ. При этом выяснилось, что природа отрицательных ионов, которые вводились в волокно вместе с калием, не слишком существенна. Если концентрация калия внутри волокна и в наружной среде была одинаковой, то потенциал покоя в полном соответствии с формулой Нернста не возникал. Если же внутрь волокна накачивали морскую воду, а в наружную среду -- раствор с высокой концентрацией калия, то знак потенциала покоя менялся: внутри волокна возникал знак «плюс», а снаружи -- «минус»; при этом величина ПП соответствовала формуле Нернста. Таким образом, введение внутрь волокна солевых растворов разного состава подтвердило результаты, полученные ранее при изменении наружной концентрации ионов калия.
Эти опыты показали, во-первых, решающую роль мембраны в возникновении ПП -- ведь протоплазма со всеми органеллами и белковыми молекулами попросту отсутствовала, а во-вторых, -- решающую роль ионов калия в этом процессе. Мембрана нервного волокна работала так, как это предсказывалось мембранной теорией Бернштейна.
Мембранная теория требует уточнений
Часто, когда теория достигает зрелости, получает признание, живет, начинает расти точность измерений и обнаруживаются отступления от теории, требующие объяснений. Законы Кеплера утверждали, что планеты движутся по эллипсам, но при более точных наблюдениях обнаружилось, что орбиты не вполне эллипсы, что существуют возмущения, которые были объяснены как результат действия на планету силы притяжения других планет. Именно учет возмущений позволил открыть планету Нептун.
То же самое произошло и с мембранной теорией. Когда методы измерения ПП и ионных концентраций достигли достаточно высокой точности, обнаружилось, что на самом деле измеряемый ПП всегда ниже, чем вычисленный теоретически по формуле Нернста. Ясно, что существовал какой-то «возмущающий» фактор, не учтенный теорией Бернштейна.
Найти причину расхождения эксперимента и теории помог опять-таки кальмар. Работая с гигантским аксоном, А. Ходжкин и Б. Катц установили, что ПП, измеряемый в опыте, оказывается ближе всего к теоретическому в одном особом случае: если из наружной среды убирается натрий.
Но причем здесь натрий? Если, как считал Берн-штейн, мембрана проницаема только для калия, то натрий вообще не должен влиять на ПП! А что если допущение Бернштейна ошибочно? Что будет, если, посягнув на «основу основ» мембранной теории, предположить, что натрий тоже проходит через мембрану? Легко понять, что тогда ионы натрия, которых снаружи клетки гораздо больше, чем внутри, будут идти по градиенту концентрации внутрь, создавая свой нернстовский потенциал, противоположный по знаку тому, который создается калием, и значит, будут снижать ПП. Это равносильно тому, что к мембране подключен не один, а два соединенных навстречу друг другу источника э.д.с. Э.д.с. этих источников определяются концентрационными градиентами калия и натрия. Ходжкин и Катц проверяют свое предположение экспериментально, меняя концентрацию натрия во внешней среде и сравнивая значения ПП с теоретическими. Оказалось, что для совпадения экспериментальных данных с расчетными приходится принять, что сопротивление, через которое идут ионы натрия в 25 раз больше, чем для калия. Это означает, что проницаемость мембраны для ионов натрия, хотя и в 25 раз меньше, чем для калия, но все же не равна нулю.
Вскоре предположение, что ионы натрия могут проходить через мембрану гигантского аксона, было прямо доказано в опытах с радиоактивным изотопом натрия. В ходе этих работ ученые открыли особое вещество, тетродотоксин, блокирующее движение натрия через мембрану. Теперь удалось показать, что если добавить в морскую воду, окружающую гигантский аксон, тетродотоксин и натрий перестает идти через мембрану, то ГШ начинает нарастать и достигает значения, в точности равного тому, которое предсказывается формулой Нернста. Тем самым роль натрия была полностью доказана.
На первый взгляд кажется, что уточнения, внесенные Ходжкином и Катцем в мембранную теорию Бернштейна, несущественны. Всего-то и оказалось, что мембрана пропускает, кроме калия, немного натрия: калий создает потенциал одного знака, натрий -- другого, в результате получается ПП чуть ниже, чем только от калия.
Однако на самом деле ситуация меняется в корне.
На мембране устанавливается некоторый промежуточный потенциал, который, естественно, не является равновесным ни для одного из этих ионов. Поэтому и тот и другой ион будут двигаться по градиенту концентрации: ионы натрия -- внутрь, а ионы калия -- наружу, пока не уравняются концентрации, по крайней мере, одного из них.
Страницы: 1, 2, 3, 4
