Необходимый набор посуды, инструментов и материалов в биотехнологической лаборатории: мерные колбы, колбы Эрленмейера, химические стаканы, мерные цилиндры, чашки Петри, пробирки, бутылки, пипетки, стеклянные палочки, стеклянные и мембранные фильтры, ланцеты (в том числе глазные, хирургические, анатомические), ножницы, пинцеты, ножи, бритвенные лезвия, препарировальные иглы, шпатели, бумага (оберточная, пергаментная, фильтровальная), фольга алюминиевая, вата, марля, шпагат.
Приготовление питательных сред для культивирования клеток и тканей in vitro.
Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.
Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора - в виде фосфатов; серы - в виде сульфатов; а также растворимых солей К+, Na+, Са2+, Мg2+. Железо используется в виде хелатов [FeО4 или Fe2O4 + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] - наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.
Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К+, Na+, Са2+, Cl -, Н + необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).
В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20-60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, раффинозой (природный трисахарид), целлобиозой.
Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы - витамины группы В: В1, В6, В12; С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит (витаминоподобное соединение).
Тиамин (В1) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой), является коферментом транскетолазы (фермент пентозомонофосфатного пути).
Пиридоксин (В6) в виде фосфорнокислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.
Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно-акцепторную электротранспортную цепь Н+ (отнятие Н+ от молекул органических веществ).
Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития - фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины.
Ауксины: ИУК - -индолил-3-уксусная кислота, ИМК - индолил-3-мас-ляная кислота, НУК - -нафтилуксусная кислота, 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.
Цитокинины: кинетин - 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенил-мочевина, 6-БАП - 6-бензиламинопурин.
Гиббереллины: гиберрелловая кислота.
В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10-15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины - кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину.
В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений - регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики - поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.
Агаризованные среды готовят на основе агар-агара - полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6-6,0. иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P10 и P200.
Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4оС; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты - при -20оС в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).
Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10-40 раз, микросолей - в 100-1000 раз, витаминов - в 1000 раз.
Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.
Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли - раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).
Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА - трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.
Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10-кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.
Фитогормоны - это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5-2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5-1н HCl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).
В таблице представлен состав наиболее часто используемых питательных сред. Как правило, начиная работать с новым объектом, исследователи модифицируют состав стандартных сред, особенно часто варьируя концентрации и набор органических компонентов.
Частные примеры питательных сред.
Приготовление маточных растворов для среды Мурасиге-Скуга.
№ п.п.
Компонент среды
Количество вещества
Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора)
1.
2.
3.
4.
KNO3
NH4NО3
KH2PO4
MgSO4 . 7H2O
или MgSO4 безводный
38
33
3,4
7,4
3,6
5.
CaCl2 . 2H2O
или CaCl2 безводный
8,8
6,65
Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора)
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Na2MoO4 . 2H2O
CuSO4 . 5H2O
H3BO3
MnSO4 . 5H2O
или MnSO4 . 4H2O
ZnSO4 . 7H2O
KJ
CoCl2 . 6H2O
25
2,5
620
2410
2230
860
83
13.
FeSO4
Na2 ЭДТА
557
745
Среда Мурасиге-Скуга (М-С) для клеточных и тканевых культур
Компоненты питательной среды
Маточный раствор макросолей
Маточный раствор микросолей
Fe-хеллат
CaCl2
Тиамин-HCl
Пиридоксин-HCl
Никотиновая кислота
Мезоинозит
Глицин
Сахароза
50 мл/л
1 мл/л
5 мл/л
0,1 мг/л
0,5 мг/л
100 мг/л
2 мг/л
30 г/л
рН 5,6-5,8
Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования апикальных меристем картофеля
Витамин В12
Фолиевая кислота
Гидролизат казеина
Аденин
Пантотенат Са
Рибофлавин
Биотин
Активированный уголь
ГК
Кинетин
Глюкоза
Агар-агар
1 мг/л
0,015 мг/л
1 г/л
40 мг/л
10 мг/л
10 г/л
20 г/л
7 г/л
рН 5,7-5,8
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7