Приготовление маточных растворов для среды Гамборга-Эвелега.

Среда Гамборга-Эвелега

Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для клубнеобразования у картофеля.

Приготовление маточных растворов для среды Блейдза.

Среда Блейдза для каллусогенеза.

Среда Блейдза для соматического эбриогенеза.

Способы стерилизации в биотехнологии

Все работы с культурой клеток и тканей in vitro проводят в стерильных (асептических) условиях в стерильном боксе или ламинар-боксе, стерильными инструментами, в стерильной посуде, на стерильных питательных средах. В случае нарушения стерильности на средах хорошо развиваются микроорганизмы (грибы, бактерии), нарушающие состав среды и подавляющие рост растительных эксплантов.

Чаще всего для стерилизации помещений (боксов для пересадки тканей, культуральных комнат) используют ультрафиолетовое облучение в течение 0,5-2 часов (в зависимости от площади помещения). Работы в облученном помещении начинают через 15-20 минут после отключения бактерицидных ламп, так как под действием ультрафиолетового излучения двухатомный кислород воздуха становится трехатомным озоном - газом, токсичным для человека. Для достижения максимальной стерильности перед обработкой УФ все поверхности тщательно отмываются моющими средствами, водой и растворами хлорсодержащих веществ, поверхности ламинар-бокса обрабатывают 96 % спиртом.

Посуду, халаты, вату, бумагу, дистиллированную воду, питательные среды стерилизуют в автоклавах под давлением пара 1-2 атмосферы и температурой 120оС в течении 20-60 мин, в зависимости от объёма стерилизуемого материала.

Колбы, штативы со средой, вату, бумагу, халаты перед автоклавированием заворачивают в целлофановую бумагу, либо помещают в бюксы.

Металлические инструменты автоклавировать нельзя, так как под действием пара образуется ржавчина. Поэтому их стерилизуют сухим жаром в термостатах с температурой 170-250оС в течении 1-2 часов или на окрытом пламени горелки, что также не иене эффективно.

Способы стерилизации растительных эксплантов

С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду.

Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов - кору, с почек - кроющие чешуи.

Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Са и Nа, сулемой), бром (бромной водой), перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками.

Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.

Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5-7 % раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5-8 минут.

Гипохлорит натрия используется в виде 0,5-5 % раствора для обработки любых эксплантов в течение 1-20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2-3 % раствор в течение 10-15 минут, а для сухих семян 3-5 % раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н HCl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.

Хлорамин применяют в концентрации 1-6 %. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1-3 минут, сухие семена - 30-60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2-3 раза.

Сулема - токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1 % раствор в течение 1-3 минут, для корне- и клубнеплодов - до 10-20 минут.

Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их непосредственно перед работой.

Диацид используется в 0,2 % растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте.

Также применяются 5%-й раствор формалина или фенола. Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10-80 мг/л, ампициллин 200-400 мг/л, левомицитин, каномицин и другие. Семена могут быть обработаны газами (оксид пропилена).

Стерилизацию можно разделить на три этапа:

- предварительная стерилизация исходного растительного материала. Условия обработки варьируют в зависимости от объекта. Хранящиеся органы промывают водопроводной водой, фрагменты стебля, корня или листа также промывают проточной водопроводной водой и помещают в спирт. Предварительная стерилизация семян - более длительная процедура, зависящая от степени их загрязнённости.

- собственно стерилизация. Предварительно простерилизованные ткани и органы помещают в стерилизующий раствор. Необходимое условие процесса стерилизации - это обеспечение достаточной степени чистоты объекта, и сохранность его жизнеспособности.

- Постстерилизация. Отмывание объекта от стерилизующего раствора порциями дистиллята.

Литература

1. Алёхина Н.Д., Балконин Ю.В., Гавриленко В.Ф. Физиология растений М.: Академия, 2005. С. 416-498, 588-593.

2. Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия М.: Дрофа, 2004. С 494-507.

3. Андреев В.П., Марков А.Г. Биология. Толковый словарь с английскими эквивалентами Санкт - Петербург: Лань, 1999.

4. Бутенко Р.Г. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений М.: Наука, 1991. С. 166 - 183.

5. Гупало П.И., Скрипчинский В.В. Физиология индивидуального развития растений М.: Колос, 1971. С. 3 - 164.

6. Сорокина И.К., Старичкова Н.И., Решетникова Т.Б., Гринь Н.А. Основы биотехнологии растений. Культура растительных клеток и тканей. Учебное пособие М.: УМК биологического факультета СГУ им. Н.Г.Чернышевского, 2002. 45 с.

7. Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Дегтярев С.В. Сельскохозяйственная биотехнология М.: Высшая школа, 1998. С. 7 - 66.

8. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков М.: Мир, 1983. С. 16.

9. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.Ф. Клеточная инженерия М.: Высшая школа, 1987. С. 7 - 49.

10. Егоров Н.С., Олескин А.В., Самуилов В.Д. Биотехнология. Проблемы и перспективы М.: Высшая школа, 1987. 150 с.

11. Носов А.М. Культура клеток высших растений - уникальная система, модель, инструмент //Физиология растений. 1999. Т. 46. №6. С. 837 - 844.

12. Соболева М.И., Логинов И.В. Статистические характеристики, маркирующие морфогенез в каллусных культурах яровой мягкой пшеницы //Физиология растений. 2004. Т. 51. № 2. С. 287 - 296.

13. Батыгина Т.Б. Эмбриогенез и морфогенез половых и соматических зародышей //Физиология растений. 1999. Т. 46. № 6. С. 884 - 898.

14. Копертех Л.Г., Стрибная Л.А. Регенерация растений из листовых эксплантов пшеницы //Физиология растений. 2003. Т. 50. № 3. С. 410 - 414.

15. Филиппова В.Н., Володина С.О., Смоленская И.Н. Экдистероиды в культурах клеток Serrtula Coronata и Ajuga Reptans //Химия растительного сырья. 2002. № 1. С. 57 - 62.

16. Мухитов А.Р. Влияние колхицина на генетическую стабильность и морфогенную активность каллусов Fagopyrum Tataricum (L.) Gaertn.: Автореферат дис… канд. биол. наук. Казань, 2000. 23 с.

17. Ветчинникова Л.В. Изучение роста и развития растений Карельской берёзы, полученных в культуре in vitro. Годичное собрание общества физиологов растений России и Международная научная конференция «Проблемы растений Севера». Петрозаводск, 2004. С. 40.

18. Медведев С.С. Полярный транспорт ИУК, как основа пространственно-временной организации процессов роста и морфогенеза растений. Годичное собрание общества физиологов растений России и Международная научная конференция «Проблемы растений Севера». Петрозаводск, 2004. С. 125.

19. Карначук Р.А., Тищенко С. Ю., Головацкая И.Ф. Эндогенные фитогормоны и регуляция морфогенеза синим светом //Физиология растений. 2001. Т. 48. №2. С. 262 - 267.

20. Дунаева С.Е., Лукьянова М.В., Ковалёва О.Н. Способность незрелых зародышей к образованию растений - регенерантов в культуре in vitro у ранее- и позднеспелых сортов ячменя. Регенерация растений в первичном каллусе, полученном от незрелых зародышей //Физиология растений. 2000. Т. 47. № 1. С. 53 - 57.

21. Власова Т.А., Гавриленко В.Ф., Ермаков И.П., Жигалова Т.В. Малый практикум по физиологии растений М.: Московский Университет, 1994. С.35 - 50.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7