Текучим паром (100 °С) обрабатывают предметы, портящиеся от сухого жара, и некоторые питательные среды, не выдерживающие более высокой температуры (среды с углеводами, МПЖ, молоко). Проводят стерилизацию в кипятильнике Коха по 30 мин в течение 3 суток ежедневно. Такая стерилизация называется дробной.
Стерилизация насыщенным паром под давлением
Это наиболее быстрый и надежный способ стерилизации, при котором гибнут самые устойчивые споры. С его помощью стерилизуют большинство питательных сред, посуду.
Обработку насыщенным паром проводят в герметически закрывающемся толстостенном котле - автоклаве. На массивной крышке или сбоку котла находятся кран для выхода пара, манометр и предохранительный клапан. Манометр показывает, на сколько давление пара внутри котла выше нормального. Для предотвращения взрыва при превышении предельного давления срабатывает предохранительный клапан, давая выход пару.
Автоклав используют и для дробной стерилизации текучим паром. В этом случае крышку не завинчивают, чтобы обеспечить свободный выход пару (Теппер, 1994).
2.5 Материалы и оборудование
Культуры микроорганизмов, пробирки, колбы, чашки Петри, бактериологические иглы, шпатели, штативы, предметные и покровные стекла, красители, спиртовая горелка.
При любой микробиологической работе: при посевах, при посевах, выделении, пересевах, сохранении чистых культур используются стерильные среды, стерильная посуда, стерильные инструменты, чтобы предотвратить возможность попадания посторонней микрофлоры.
Для стерильной посуды используется стерилизация сухим жаром. Она производится нагреванием в течение 2 часов, при температуре 1700°С (считая с того момента, как температура установилась) в печи Пастера или в электросушильных шкафах (с нагревом до 2000).
Вся посуда перед стерилизацией должна быть вымыта, высушена и завернута в бумагу.
Для заворачивания посуды при стерилизации в автоклаве, используют газетную бумагу (которая не размокает).
Большинство питательных сред стерилизуют насыщенным паром под давлением в автоклавах. Повышение давления в автоклаве повышает температуру пара, образуемого внутри автоклава и следовательно, температуру стерилизации.
Приготовление почвенной суспензии и посев на среды
На стерильную бумагу отвешивают 10 г почвы. Навеску почвы переносят в колбу на 250 мл со 100 мл стерильной водопроводной воды, взбалтывают 10 мин (лучше на механической качалке) и дают отстояться грубым частицам почвы.
Из каждого предыдущего разведения отдельной стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии и переносят в следующую пробирку с 9 мл воды. Всякий раз пипетку ополаскивают и отставляют. Последующие пробирки встряхивают по 1 мин.
Из полученных разведений делают посев на плотные среды. Набор сред зависит от задач бактериологического анализа почвы. На плотные питательные среды посев проводят преимущественно поверхностно, но мы использовали преимущественно глубинный посев.
При определении количества бактерий в почве использовались следующие среды: Глюкозо-петонная, Глюкозо-аммонийная, Сабуро, Эшби с сахарозой, и МПА.
Для глубинного посева берут 1 мл почвенной суспензии из разведения на порядок меньшего, чем для поверхностного посева.
Суспензию вносят в стерильную чашку Петри, заливают агаром, расплавленным и охлажденным до 45°С, и смешивают с ним. При глубинном посеве показатели получаются более низкие, чем при поверхностном (Теппер, 1994).
Техника взятия культуры для приготовления препарата
Пробирку с культурой держат в левой руке почти в горизонтальном положении вблизи горелки. Перед взятием культуры правой рукой вынимают ватную пробку из пробирки, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают на пламени горелки. Иглу держат в правой руке большим, указательным и средним пальцами. Обожженной в пламени бактериологической иглой из пробирки берут небольшое количество микробной массы.
Если культуру берут из жидкой среды, не следует сильно наклонять пробирку, чтобы не смочить ее края и пробку. Для взятия культуры лучше пользоваться петлей. После взятия культуры края пробирки и пробку обжигают в пламени и закрывают пробирку.
Фиксированные препараты микроорганизмов
Вводные пояснения. В микробиологии часто готовят фиксированные препараты. Их рассматривают под микроскопом в окрашенном виде. Под фиксацией подразумевается такая обработка живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация необходима в случае работы с патогенными микроорганизмами (в целях безопасности).
В случае, если суспензия густая, ее сначала разводят водой. Для этого прокаленной петлей берут немного суспензии и переносят в каплю воды на другое предметное стекло. Суспензию нормальной густоты размазывают тонким слоем по стеклу, затем мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или при слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется для избежания коагуляции белков, искажающей структуру и форму клеток. Высушенный препарат фиксируют (Теппер, 1994).
Окрашивание препарата. При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания варьирует от 1 до 5 мин, в отдельных случаях занимая до 30 мин и более. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.
Существуют простые и дифференцированные методы окраски.
При простой окраске используют какой-либо один краситель, например метиленовый синий, фуксин, генциан фиолетовый в щелочных или карболовых растворах. При этом прокрашивается вся клетка.
При дифференцированной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями. Таковы методы окраски по Грамму, окраски спор.
Окрашивание препарата по способу Грама
Чистые культуры выделялись на среду Сабуро (см. Приложение №1), т.к. она содержит все необходимые питательные вещества для роста дрожжей.
Полученную культуру проверяем на чистоту методом посевов на селективные плотные питательные среды.
2.9 Получение культуральной жидкости
С помощью шпателя отбиралась биомасса культуры дрожжей, затем ее помещали в жидкую питательную среду (Сабуро). Культура инкубировалась в течение 1 недели в аэробных условиях, в данном случае мы использовали «качалку». После инкубации полученная жидкость центрифугировалась и стерилизовалась при 1 атмосфере.
В полученной культуральной жидкости могут присутствовать различные кислоты (молочная, масляная, пропионовая, яблочная), многоатомные спирты (глицерин, ксилит, эритрит, арабит), некоторые витамины группы В, в частности рибофлавина.
Выделение почвенных дрожжей производилось чашечным методом, путем высева на различные питательные среды. Рецепт среды см. в приложении.
Проба №1 - почва с полевая (не посевная).
Проба №2 - почва лесная.
Проба №4 - почва с луговая (заливная).
Проба №5 - почва из грибницы шампиньона.
Вероятно это можно объяснить тем, что эти почвы бедны легко доступными элементами питания. На этих почвах очень маленькая растительность, а как нам уже известно в основном они попадают в почв с растительным опадом. Почва не является для них истинным местом обитания, а лишь «ловушкой», местом сохранения или постепенного отмирания.
Результаты исследований свидетельствуют, что разлагающиеся растительные остатки: опад, лесные подстилки, отмершие части мхов, торф - представляют собой типичные места обитания многих видов дрожжей. Свежий растительный опад, состоящий из листьев растений, сохраняющих анатомическое строение, практически всегда содержит дрожжи в количестве не меньшем, чем на надземных частях растений. В некоторых случаях численность дрожжей в опаде даже выше, чем на живых частях растений. Плотность заселения дрожжами растительного опада в значительной степени определяется количеством дрожжевых клеток изначально присутствовавших на листьях растений (Максимова, Чернов, 2004.)
С повышением степени разложенности растительных остатков средняя численность дрожжей убывает. В образцах нижних слоев лесной подстилки, перегнойных горизонтах почв дрожжи обнаруживаются далеко не всегда, и численность их может снижаться.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5
