-обнаружение и идентификацию антигена вируса ящура в РСК (определение его типовой и вариантной принадлежности);
-обнаружение и титрование антител к вирусу ящура у переболевших животных (реконвалесцентов) в реакции радиальной им-мунодиффузии (РРИД) и непрямой реакции иммунофлуоресцен-ции (НРИФ).
Обнаружение и идентификация антигена вируса ящура с помощью РСК. Компоненты реакции: испытуемые антигены из эпизоотических штаммов вируса от заболевших животных; сыворотки морских свинок, гипериммунизированных стандартными типовыми и вариантными штаммами вируса ящура (биофабричного производства); антигены контрольные -- из типовых и вариантных штаммов вируса ящура (биофабричного производства); комплемент -- свежая или сухая нормальная сыворотка морских свинок; гемолизин биофабричного производства; эритроциты барана -- в виде 2%-ной взвеси на физиологическом растворе; 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия на дистиллированной воде; набор специфических сывороток и антигенов к другим вирусам, вызывающим везикулярные поражения.
РСК ставят в различных объемах: в общем объеме 1 мл -- берут 0,2 мл каждого компонента, в общем объеме 0,5 мл -- берут 0,1 мл каждого компонента или микрометодом -- общий объем 0,125 мл, при этом каждый компонент равен 0,025 мл.
Приготовление антигена вируса ящура.
Стенки афт от больных животных отмывают от консервирующей жидкости физиологическим раствором рН 7,4--7,6, высушивают фильтровальной бумагой, взвешивают, измельчают и тщательно растирают в фарфоровой ступке со стерильным битым нейтральным стеклом до получения однородной массы, к которой добавляют двойное по отношению к массе афт количество физиологического раствора (Dii 7,4--7,6), т. е. на 1г афт --2 мл раствора. Полученную 33% суспензию экстрагируют при комнатной температуре 2 ч, промц раживают при минус 10 -- 20 "С в течение 5 -- 18 ч. После размораживания центрифугируют 15--30 мин при 3000--5000 мин-1. Надосадочную жидкость инактивируют при 58 °С 40 мин. После инактивации, если в жидкости остаются хлопья, ее центрифугируй повторно 10--15 мин при 3000 мин-1 и затем используют в качестве антигена в РСК.
Этапы постановки РСК.
Титрование гемолизина. Проводят при получении новой серии по общепринятой методике. В главный опыт берут гемолизин в 4-кратной концентрации от его предельного титра (рабочее разведение).
Приготовление гемолитической системы (гемсистемы). Для этого смешивают гемолизин в рабочем разведении с равным количеством 2%-ной взвеси эритроцитов барана.
Титрование комплемента. Проводят в гемолитической системе в день постановки главного опыта по общепринятой методике. Для главного опыта РСК комплемент берут с излишком в 1 % от его титра в гемсистеме. Правильно взятая рабочая доза комплемента -- непременное условие нормального течения реакции, что обеспечивает достоверность результатов.
Приготовление рабочего разведения типоспецифических сывороток. В главный опыт для определения типа вируса ящура сыворотки используют в удвоенном титре (от предельного титра), например, если предельный титр сыворотки составляет 1 :40, то рабочий титр будет 1 : 20.
Приготовление рабочего разведения типоспецифических антигенов. Антигены также используют в удвоенных титрах, например, если предельный титр равен 1 : 6, то рабочий титр будет 1 : 3.
Испытуемый антиген в реакции исследуют цельным ( 33%-ная взвесь) и в разведениях 1:2, 1:4 и 1:8.
Примечание. По представленным результатам все стандартные антигены и сыворотки активны и типоспецифичны. Испытуемый антиген относится к типу А.
Учет реакции ведут через 5 -- 10 мин после водяной бани, и окончательный результат получают через 10-- 12 ч. Степень задержки гемолиза оценивают в крестах: (++++) -- 100%-ная задержка гемолиза; (+++) -- 75%-ная; (++) -- 50%-ная; (+) -- 25%-ная задержка гемолиза; (-) -- полный гемолиз.
Если испытуемый антиген гомологичен специфическим антителам, то будет задержка гемолиза и реакция будет положительной; если же гомологичные антитела отсутствуют, реакция отрицательная и наблюдается полный гемолиз.
При производственной необходимости после определения типовой принадлежности вируса ящура устанавливают его подтип (вариант). Для этого ставят РСК по той же методике, но используют вариантные сыворотки и вариантные антигены установленного типа. Причем вариантные сыворотки используют в предельном титре, а антигены в удвоенном. Антиген (исследуемый) относят к тому варианту, с сывороткой которого он дает положительную реакцию в более высоких разв Едениях .
Заключение. Испытуемый штамм относится к варианту A22.
Когда доставленного из хозяйства вирусного материа недостаточно для исследования в РСК, проводят его расплодку на культуре клеток или на 3-6-дневных мышатах-сосунах, или на взрослых морских свинках. Мышатам исследуемую суспензию вводят подкожно в области спины в дозе 0,1--0,2 мл, морским свинкам -- внутрикожно в подушечки обеих задних конечностей в дозе 0,2--0,5 мл. За животными наблюдают 5--7 дней.
В случае гибели мышат из их тушек готовят антиген для РСК. У морских свинок в положительных случаях на лапках образуются афты; стенки афт и их содержимое используют в РСК. При необходимости проводят 2--3 "слепых" пассажа. Пробу исследуемого материала считают отрицательной, если в третьем пассаже не будет отмечено дегенерации клеток и падежа белых мышей, а при исследовании полученных из них суспензий в РСК не будет обнаружен антиген вируса ящура.
Ретроспективная диагностика.
Материалом для исследования на наличие антител к вирусу ящура служат сыворотки крови животных, подозреваемых в переболевании ящуром или другими везикулярными болезнями. Сыворотки крови должны быть взяты не ранее чем через 7 дней с момента появления у животных признаков везикулярного заболевания. На исследование следует направлять 5--10 проб сыворотки от животных каждой возрастной группы. При сомнительных результатах первичного исследования необходимо отобрать кровь повторно от тех же животных через 7-- 10 дней.
Сыворотку, полученную общепринятым методом, консервируют антибиотиками (по 500 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина) или замораживают при минус 20 °С. На исследование направляют от каждого животного не менее 5 мл сыворотки в термосе со льдом.
В лаборатории сыворотку исследуют с помощью реакции радиальной иммунодиффузии (РРИД) и реакции непрямой иммунофлуоресценции (НРИФ).
РРИД. Сущность реакции заключается в формировании зоны специфической преципитации вирусных антигенов антителами, включенными в состав агарового геля. РРИД типоспецифична.
Для постановки реакции расплавленный 2%-ный агар смешивают с равным объемом нагретой до 50--55 °С испытуемой сыворотки в разведениях 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20 и т. д. до 1 : 320 и наносят по 4 мл на предметное стекло. В застывшем агаре вырезают лунки (диаметром 4--7,7 мм), которые заполняют эталонными типовыми антигенами. Затем стекла помещают во влажную камеру при температуре 37 °С. Результаты учитывают через 6--7 ч и окончательно через 18 ч.
Положительная реакция характеризуется образованием кольца преципитации в виде опалесцирующей зоны вокруг лунки с антигеном, гомологичным возбудителю, вызвавшему заболевание .
Антитела, обнаруженные в испытуемой пробе сыворотки, относят к тому серотипу, с антигеном которого они дали положительную реакцию. Их титром считают максимальное разведение испытуемой сыворотки, с которым наблюдается положительная реакция.
После переболевания животных титры антител обычно превышают 1 : 160.
НРИФ. Данная реакция основана на том, что наличие антител в сыворотке крови переболевших животных выявляет специфическое свечение (комплекса антиген + антитело), а при использовании сывороток от вакцинированных животных свечение комплекса не наблюдается.
Техника постановки заключается в следующем. На препарат из культуры клеток ВНК-21, ПЭК, ПЭС, инфицированных вирусом ящура любого типа, наносят испытуемую сыворотку в разведении 1: 10 и 1 :20; инкубируют во влажной камере при 37 °С 30 мин; отмывают несвязавшиеся антитела; подсушивают на воздухе и окрашивают смесью рабочих разведений флуоресцирующей антивидовой сыворотки и бычьего альбумина, меченного родамином; Инкубируют во влажной камере при 37 °С 30 мин; отмывают; подсушивают и просматривают под люминесцентным микроскопом (объектив х40, окуляр х4 или х5). Положительная реакция характеризуется зеленым или из рудно-зеленым свечением цитоплазмы клеток.
Диагностический результат считают положительным при обнаружении специфического свечения хотя бы в одной из 5--10 сывороток, присланных из данного хозяйства.
Для определения уровня обнаруженных таким образом антител в испытуемой сыворотке проводят ее титрование. Для этого испытуемую сыворотку разводят от 1 : 40 до 1 : 1280, и каждым разведением обрабатывают заведомо инфицированный препарат, как было указано выше. О титре постинфекционных антител в сыворотке судят по предельному ее разведению, которое способно давать положительную НРИФ. Наличие специфического свечения в препаратах, обработанных испытуемой сывороткой в разведениях 1 : 10, 1 : 20 и 1 : 40, свидетельствует о том, что сыворотка была получена в период острого переболевания животного ящуром, т. е. с момента его заболевания прошло около 7 дней, а наличие специфического свечения в разведениях 1 : 80 и выше -- о том, что сыворотка взята от животного-реконвалесцента.
Результаты исследования на ящур оформляют в виде протокола, в котором указывают дату исследования, наименование хозяйства, материала, краткие эпизоотологические данные и т. д. и обязательно наименование компонентов, используемых в исследовании, характеристику контролей.
Необходимо отметить, что для индикации и типирования вируса ящура разработано много других методов, таких, как ПЦР, РНГА, ИФА, метод перекрестного иммунитета и др.; для обнаружения и типирования антител -- РН, РНГА, реакция серозащиты на мышатах-сосунах и др.
Дифференциальная диагностика. Необходимо исключить другие заболевания животных с везикулярным синдромом, такие, как ВД, ИРТ, везикулярный стоматит, у свиней -- везикулярную болезнь, везикулярную экзантему, у овец -- катаральную лихорадку.
Иммунитет и специфическая профилактика.
Продолжительность иммунитета у животных, переболевших ящуром, составляет 8--12 мес, у свиней -- 10--12, у овец -- 18 мес. При очень напряженном иммунитете может наблюдаться некоторая устойчивость к заражению гетерологичным типом вируса. При ящуре возникает тканевой и гуморальный иммунитеты. Основное значение в защите животных от заболевания принадлежит гуморальным факторам иммунитета. Для специфической профилактики ящура применяют инактивированные вакцины. В нашей стране нашли широкое применение следующие 3 вакцины: лапинизированная гидро-окисьалюминиевая сапонинформолвакцина, которую готовят из вируса, репродуцированного в организме новорожденных крольчат; гидроокисьалюминиевая сапонинформолвакцина из вируса, культивируемого в ткани слизистой оболочки языка.
Для свиней используют противоящурную эмульгированную вакцину из лапинизированного вируса.
Иммунитет после вакцинации у взрослых животных длится 4-- 6 мес. После ревакцинации иммунитет более напряженный и продолжительный.
Молодняк, родившийся от иммунных животных, получает пассивно антитела с молозивом. Антитела у телят сохраняются в течение 5 мес, хотя пассивная защита продолжается до 3--4 мес.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
