4. Культивирование вирусов в культуре клеток

Культуры клеток и тканей - это кусочки органов и тканей, выращенных в питательной среде вне организма, сохраняют жизнеспособность, а некоторые размножаются.

Для культивирования необходимы:

- исходный материал (ткани эмбрионов, клетки почки, кожи, селезенки). Обязательо соблюдение правил асептики и антисептики;

- температура должна быть 36 -38 градусов Цельсия;

- питательная среда , которая должна обладать буферностью и изотоничностью, т.е. включать в себя Na, K, Ca, Mg, Cl, фосфаты, карбонаты;

- РН среды должна быть 7,2 - 7,4 единиц;

- все питательные элементы, особенно глюкоза, которая отвечает за энергетический обмен;

- аминокислоты;

- витамины, которые являются ко-ферментами.

Среды бывают двух видов:

1. натуральные или естественные ( кровь, амниотическая жидкость);

2. 2.синтетические и полусинтетические (из химических веществ, солевые растворы - раствор Эрла и раствор Хэнкса)

Методика сводится к следующему:

1. подбору культуры клеток;

2. получению вирус -содержащего материала;

3. подготовке для заражения;

4. заражению клеток вируссодержащим материалом;

5. культивированию вируса в клетках;

6. индикации вируса в культуре клеток;

7. сбору культуральной жидкости и идентификации в ней вируса.

Подбор культур клеток. Не всякая клетка чувствительна к любому вирусу. Вирус к первичной культуре обычно успешно адаптируется при условии, если культура получена из органов животного, естественно восприимчивого к данному вирусу. Однако адаптация вируса к перевиваемым клеткам более сложна, а в ряде случаев неосуществима. Для культивирования некоторых вирусов до сих пор неизвестно ни одной клеточной системы. Для культивирования вируса используют обычно молодые клетки, т. е. в первый день формирования монослоя, а в некоторых случаях (для парвовирусов свиней) клетки заражают при их посеве, так как вирус интенсивно размножается при наличии делящихся клеток (когда они находятся в стадии логарифмического роста).

Заражение клеток.

Для этого отбирают пробирки (или матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сливают, клетки 1--2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные антитела и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1--0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распределяют его равномерно по слою клеток. В таком виде пробирки (матрасы) оставляют от 1 до 2 ч при 22 или 37 "С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Затем вируссодержащий материал удаляют из пробирок (матрасов) и наливают поддерживающую среду (в пробирку 1--2 мл, в матрасы около 10% его объема). При выделении вируса из патологического материала некоторые пробы (фекалий и др.) могут оказывать токсическое действие на клетки, поэтому после адсорбции вируса монослой клеток отмывают 1--2 раза раствором Хенкса (или питательной средой) и затем наливают поддерживающую среду.

Культивирование вируса.

Пробирки (матрасы) закрывают герметически резиновыми пробками и ставят на инкубацию в термостат при 37 °С. Наиболее широко применяют стационарное инкубирование. При этом матрасы кладут в горизонтальном положении, пробирки -- под углом 5° так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). В ряде лабораторий зараженные культуры клеток инкубируют на вращающейся системе -- роллерах. Используя этот метод, удается получать большой выход вируса, имеющего более высокий инфекционный титр, чем при стационарном культивировании.

Для каждой пробы материала обычно используют не менее 4--10 пробирок с культурой клеток. Для контроля оставляют 4--6 пробирок с незараженной культурой клеток, в которых заменяют ростовую среду на поддерживающую.

В культурах клеток, зараженных вирусом, питательную среду можно не менять в течение 7 дней, а рН среды (6,9--7,4) поддерживать с помощью 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия. При более длительном культивировании инфицированных клеток (аденовирусы и др.) среду меняют.

Все пробирки (матрасы) после заражения клеток ежедневно исследуют под малым увеличением микроскопа, сравнивая культуры клеток, зараженные вирусом, с контрольными.

В термостате адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают внутрь их и начинается их репродукция. Новые вирусные частицы покидают (полностью или частично) клетки, в которых они образовались, проникают в непораженные клетки, репродуцируются в них, переходят в новые клетки и поражают их. Так продолжается до тех пор, пока есть живые неповрежденные клетки. В результате этого процесса практически все клетки в матрасе или пробирке поражаются вирусом, хотя абсолютно все почти никогда не поражаются.

Вирус накапливается в основном в культуральной жидкости, но часть вирионов может оставаться и внутри не разрушенных вирусом клеток. Чтобы оставшийся в клетках вирус освободить, клетки тщательно разрушают или многократным замораживанием -- оттаиванием (2--3 раза), или с помощью ультразвука.

Индикация (обнаружение) вируса в культуре клеток.

Существуют следующие основные методы индикации вируса в культуре клеток: по цитопатическому эффекту, или цитопатическому действию (ЦПЭ,ЦПД); по положительной реакции гемадсорбции (РГАд); по образованию бляшек; по обнаружению внутриклеточных включений; по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции (РИФ); по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией и др.

ЦПД.

Наиболее широко и часто о размножении вируса в культуре клеток судят по цитопатическому эффекту, или цитопатическому действию. ЦПД называются любые изменения клеток под влиянием размножающегося в культуре клеток вируса. Физиологические изменения клеток установить довольно сложно, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно положить на предметный столик микроскопа пробирку или матрас слоем клеток вверх и, используя малое увеличение (объектив х8--10, окуляр х7--10), осмотреть слой. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с такими же клетками в пробирке, не подвергавшимися заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскоп отличия зараженной культуры клеток от контрольной можно считать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь монослой или отмечаться только в виде небольших очажков измененных клеток в слое нормальных клеток. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена вирусом. Хотя общепринятой системы оценки интенсивности ЦПД нет, ее часто оценивают в крестах или баллах. Так, если изменению (по сравнению с контролем) подвергся весь монослой в пробирке или матрасе, ЦПД оценивают на четыре креста, если 3/4 -- на 3 креста, если 1/2 - на 2 креста, 1/4 -- на один крест. Но эти оценки все же весьма условны.

Формы ЦПД зависят от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т. д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2--3 сут после заражения (энтеровирусы), другие -- через 1--2 нед (аденовирусы).

Наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация клеток, округление клеток, симпластообразование (рис. 1,2)

Фрагментация -- разрушение клеток на отдельные фрагменты, которые отделяются от стекла и переходят в культуральную жидкость в виде клеточного детрита (вирус везикулярного стоматита).

Округление -- потеря клетками способности прикрепляться к стеклу, вследствие чего клетки, обычно распластанные по стеклу, принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральной жидкости, где и погибают (энтеровирусы, аденовирусы и др.).

Симпластообразование -- растворение клеточных оболочек, вследствие чего цитоплазмы соседних клеток сливаются, образуя одно целое, в котором располагаются (главным образом по периферии) ядра клеток. Такие образования из цитоплазматической массы с многими клеточными ядрами называются симпластами (гигантские многоядерные клетки). Их образование объясняют двояко: нарушением процесса деления клеток под влиянием вируса или тем, что некоторые вирусы содержат фермент (лецитиназу), который растворяет клеточные оболочки, в результате цитоплазмы расположенных рядом клеток сливаются. ЦПД в культуре клеток способно вызывать большинство вирусов, поэтому этот метод индикации вирусов в культуре клеток применяют очень широко. Однако есть вирусы, которые, размножаясь в культуре клеток, ЦПД не вызывают (вирусы бешенства, классической чумы свиней, некоторые штаммы вируса диареи крупного рогатого скота и др.). Клетки остаются жизнеспособными, но интенсивность клеточного деления понижается, со временем изменяется и их морфология.

При неопластической трансформации пораженных клеток в монослое образуются плотные фокусы трансформации различной величины и формы, белого цвета (вирус саркомы Рауса).

Отсутствие ЦПД в первом пассаже еще не говорит об отсутствии вируса, который не всегда размножается настолько быстро, чтобы вызвать ярко выраженное ЦПД. Поэтому и прибегают к "слепым" пассажам. Необходимо провести не менее трех "слепых" пассажей, прежде чем судить о наличии вируса в исследуемом материале.

РГАд. Гемадсорбция -- соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток -- впервые была обнаружена Фогелем и Щелоковым (1957) на культуре ткани, инфицированной вирусом гриппа. В последующем выяснилось, что этой способностью обладает ряд других вирусов: парагриппозные, оспо-вакцины и оспы, ньюкаслской болезни, гриппа млекопитающих и птиц. Наиболее ценным оказалось применение этой реакции для выявления и идентификации парагриппозных вирусов животных (ПГ-3 крупного рогатого скота, парагриппа овец, вируса Сендай). В основе этого явления лежит родство рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации. Преимущество этой реакции состоит в том, что она становится положительной еще до появления отчетливых цитопатических изменений в инфицированных клетках. Для постановки реакции используют эритроциты морской свинки, обезьян, человека (группы О) и другие эритроциты, чувствительные к гемагглютинирующему действию изучаемого вируса.

Методика РГАд

Состоит в следующем. На 3--4-й день после инфицирования клеток берут две пробирки с одинаковой культурой клеток, из которых одна заражена вируссодержащим материалом, а вторая контрольная. Из обеих пробирок сливают культуральную жидкость и вносят в обе по 2--3 капли 0,5%-ной суспензии отмытых эритроцитов. Обе пробирки оставляют на 5--10 мин так, чтобы эритроциты были на поверхности клеток (кладут горизонтально на стол), а затем слегка споласкивают физраствором и исследуют под микроскопом (малое увеличение). В контрольной пробирке эритроциты полностью удаляются с физраствором, а некоторые из оставшихся плывут вместе с жидкостью. Если в зараженной пробирке эритроциты не удалились с физраствором и не плывут, а прикреплены к поверхности клеток, следует считать РГАд положительной

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6