Ассоциации А-киназы II типа мозга с мембранной фракцией клеток обусловлены только Р-субъединицей. цАМФ при диссоциации холофермента высвобождает из мембранно-связанного состояния только К-субъединицу; таким образом, компартментализация К-субъединицы изменяется при активации А-киназы. Молекула этой субъединицы гидрофильна, поэтому диссоциация мембранно-связанной А-киназы II типа приводит к транслокации каталитической субъединицы в цитоплазму и далее в ядро. Предполагается, что такая транслокация может обусловливать цАМФ-зависимое изменение экспрессии генов в нейронах, наибольшая концентрация Р-субъединиц А-киназы II типа обнаружена в пре- и постсинаптической мембранах, что свидетельствует о важной роли этой киназы в синаптической передаче.
Различия между регуляторными субъединицами А-киназы II типа нервной и других тканей проявляются также и во взаимодействии этих субъединиц с субстратами киназы. Так, для Р-субъединицы II типа из мозга характерно тесное взаимодействие с МАР-2 - нейроспецифическим белком, локализованным в отростках нейронов, кальцинейрином и другими белками. Такое взаимодействие Р II с субстратами А-киназы может приводить, с одной стороны, к локализации А-киназы II типа около специфических субстратов и, соответственно, в определенных внутриклеточных компартментах, что, очевидно, имеет важное физиологическое значение. С другой стороны, кроме связывания К-субъединицы Р-субъединица II типа нервной ткани может участвовать в регуляции функционирования других белков.
Регуляция активности протеинкиназы А осуществляется несколькими путями. Так, во многих тканях, в том числе и нервной, обнаружен низкомолекулярный термостабильный ингибитор киназы. Ингибитор связывается со свободной К-субъединицей и угнетает ее ферментативную активность. Вероятно, физиологическая роль ингибитора состоит в блокаде фосфорилирующей активности при "базаяном", т.е. нестимулируемом уровне цАМФ. В мозге наблюдается изменение концентрации ингибитора в ответ на некоторые гормональные сигналы, что может иметь определенное значение в долговременной регуляции активности А-киназы. Регуляция активности киназы II типа осуществляется также аутофосфорилированием ее Р-субъединицы; это ведет к повышению активности фермента, что обусловлено уменьшенной скоростью реассоциации фосфорилированной Р со свободной К-субъединицей. Киназа I типа также может быть фосфорилирована, но фосфорилирование ее Р-субъединицы осуществляется цГМФ-зависимой протеинкиназой. Установлено ау-тофосфорилирование К-субъединицы, однако функциональное значение этого процесса неизвестно.
Возможно, что фосфорилирование с помощью свободной К-субъединицы А-киназы и соответствующая активация фосфопротеинфосфатазного ингибитора I, приводящая к снижению активности фосфопротеинфосфатазы I, уменьшает дефосфорилирование комплекса Р-цАЛ1Ф и, следовательно, способствует диссоциации киназы II типа по принципу положительной обратной связи. Такое событие наряду с компартментализацией цАМФ в клетке может способствовать эффективной активации цАМФ-зависимой киназы при незначительном увеличении внутриклеточного уровня цАМФ.
цАМФ-зависимое фосфорилирование белков нервных окончаний оказывает существенное влияние на синаптическую передачу. Так, установлено, что мутации у дрозофил, изменяющие метаболизм цАМФ, приводят к плейотропным нарушениям механизма обучения. У моллюска аплизии серотонинергическая синаптическая передача усиливается инъекцией цАМФ в нейрон или инкубацией ганглия с блокаторами фосфодиэстеразы. Так как известно, что входящий ток кальция является непременным посредником в осуществлении синаптического действия, полагают, что серотонин усиливает такой ток посредством повышения внутриклеточного уровня цАМФ и активности А-киназы. Прямые доказательства осуществления этого механизма получены в экспериментах, где отмечено увеличение Са-проводимости нейронов улитки при инъекции в них К-субъединицы А-киназы. Блокаторы протеинкиназы А оказывают противоположный эффект - быстрое снижение Са-проводимости.
Повышение уровня ионизированного Са+ внутри клетки при открывании Са-каналов может способствовать снижению в ней содержания цАМФ за счет активации Са - КМ-зависимой фосфодиэстеразы и по принципу отрицательной обратной связи приводить к переходу Са-каналов в неактивное состояние. Введение в нейрон теофиллина замедляет процесс ослабления Са-проводимости. Таким же влиянием на кальциевую проводимость обладают ингибиторы кальмодулина, например трифтазин.
Таким образом, функционирование Са-каналов прямо регулируется протеинкиназой А, осуществляющей фосфорилирование их белковых компонентов, а также опосредованно контролируется гормонами, медиаторами и другими факторами, вызывающими или активацию аденилатциклазы, или ее ингибирование. При нарушении фосфорилирования каналы быстро теряют способность активироваться под действием изменения трансмембранного электрического поля. В течение некоторого времени это состояние является обратимым и фосфорилирование снова переводит каналы в рабочее состояние либо изменяя кинетику их активации, либо включая ранее неактивные каналы. При длительном нарушении цАМФ-зависимого фосфорилирования каналы подвергаются необратимым изменениям.
Дополнительный путь для токов Са+ внутрь клетки могут образовывать хемоуправляемые каналы, непосредственно активируемые медиаторными веществами в ответ на их взаимодействие с рецепторами. В отличие от электроуправляемых Са-каналов время жизни этих каналов существенно больше, однако относительное количество ионов, переносимых через хемоуправляемые каналы, вероятно, невелико по сравнению с электроуправляемым путем. По ряду данных хемоуправляемые каналы полностью инактивируются при увеличении внутриклеточного содержания цАМФ.
Заслуживает также рассмотрения участие цАМФ в К- и Na-проводимости мембраны.
Известно, что болевое раздражение усиливает рефлекс втягивания жабры у моллюска эплизии за счет модуляции секреции передатчиков сенсорными нейронами. Повышение чувствительности происходит за счет снижения К-проводимости и соответствующего увеличения продолжительности потенциала действия, в результате чего усиливаются Са-рефлекс и экзоцитоз. Болевое раздражение вызывает выделение серотонина "облегчающим" нейроном в окончаниях сенсорных нейронов. Серотонин, в свою очередь, увеличивает синтез цАМФ, активность протеинкиназы А и степень фосфорилирования белка, тесно связанного с К-каналом. В результате происходит закрытие канала. Блокада К-каналов приводит к тому, что приходящий в нервное окончание потенциал действия спадает медленно: "продленные" потенциалы действия удерживают потенциал-зависимые Са-каналы в открытом состоянии, вследствие чего приток ионов Са возрастает. Это, в свою очередь, ведет к опорожнению большего числа синаптических пузырьков. К блокаде К-каналов приводит также добавление АТФ и К-субъединицы протеинкиназы А в мембранные препараты нейронов; добавление протеинфосфатазы обусловливает открывание К-каналов.
Электрозависимые Na-каналы ответственны за формирование потенциала действия в возбудимых мембранах. Установлено, что в синаптосомах мозга а-субъединица №^каналов, играюшая центральную роль в функционировании этих каналов, фосфорилируется как эндогенной, так и экзогенной протеинкиназой А. Фосфорилирование приводит к ингибированию активированного нейротоксинами входящего Na-тока. Таким образом, активность Са-каналов, К-каналов и Na-каналов нейронов модулируется под действием протеинкиназы А и / или через изменение скорости их дефосфорилирования протеинфосфатазами.
Отметим, что протеинкиназа А в нервной ткани регулирует также чувствительность р-адренорецепторов к агонистам. Так, десенситизация этих рецепторов коррелирует с их цАМФ-зависимым фосфорилированием. Установлена также регуляция А-киназой биосинтеза самих р-агонистов. Эта регуляция осуществляется с помощью цАМФ-зависимого фосфорилирования тирозингидроксилазы - узлового фермента биосинтеза катехоламинов. Такое фосфорилирование может быть составной частью механизма ускорения биосинтеза катехоламинов в ответ на нервный импульс или секрецию нейромедиаторов в нервной ткани в условиях in vivo,
Остановимся на роли цАМФ и еще одного вторичного посредника - 2', 5'-олигоаденилата в регуляции пролиферации и дифференцировки нервных клеток. 2-5А - это олигонуклеотид, состоящий из нескольких остатков АМФ, связанных 5'-фосфодиэфирной связью. В клетке существуют 2 фермента, обеспечивающие определенный уровень 2-5А. Олигосинтетаза - фермент биосинтеза 2-5А, активен лишь в присутствии двуспиральной РНК; молекулярная масса - 100-105 кД. 2'-Фосфодиэстераза гкдролизует 2-5А до АМФ и АТФ, молекулярная масса этого фермента около 40 кД.
Чтобы оценить биохимическое и физиологическое значение процессов образования 2-5А, необходимо остановиться на механизмах подавляющего влияния цАМФ на пролиферативный статус нервных клеток. Так, действие ряда факторов, в частности фактора роста нервов, а также повышение уровня цАМФ, вызванное теофиллином или дибутирил-цАМФ, приводит к остановке деления и дифференцировке этих клеток. Действие теофиллина в отличие от фактора роста нервов или дибутирильного аналога цАМФ носит кратковременный характер. Повышение концентрации цАМФ в результате ингибирования фосфодиэстеразы под действием теофиллина, как и в случае фактора роста нервов и дибутирил-цАМФ, приводит к блокаде активного деления и дифференцировке нервных клеток. Однако в дальнейшем падение активности фосфодиэстеразы, обусловленное теофиллином, и соответствующее увеличение уровня цАМФ компенсируется индукцией биосинтеза этого фермента. Именно этим и объясняется кратковременное действие теофиллина.
Повышение уровня цАМФ в нервных клетках, вызванное действием факторов, непосредственно влияющих на аденилатциклазную систему, сопровождается более чем 10-кратным увеличением концентрации 2-5А. Установлено, что рост уровня олиго синтетазы и концентрации 2-5А наблюдается при дифференцировке клеток и замедлении клеточного деления.
Исследование биологических свойств 2-5А показало, что этот олигоиуклеид способен обратимо активировать специфическую латентную нуклеазу, ускорять гидролиз РНК и, таким образом, ингибировать синтез белка in vivo и тормозить процесс размножения клеток. Следовательно, повышение уровня 2-5А и изменение концентрации цАМФ является частью универсального механизма регуляции клеточного деления. К настоящему времени установлены два взаимодополняющих процесса, с помощью которых осуществляются эти регуляторные реакции. С одной стороны, стимуляция А-киназы при повышении уровня цАМФ приводит к фосфорилированию белка сМг - 18 кД. Этот белок в виде фосфоформы является ингибитором активности 2' - фосфодиэстеразы - фермента гидролиза 2-5А. С другой стороны, повышение концентрации цАМФ внутри клетки вызывает индукцию олиго синтетазы. осуществляющей синтез 2-5А.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
