При стимулировании происходит связывание Са+ с КМ. В результате кальмодулин претерпевает конформационные изменения: экспонирование гидрофобного участка при этом - важное условие для последующего взаимодействия КМ с акцепторными белками. Среди ферментов-исполнителей, активность которых модулируется в присутствии КМ, непосредственное отношение к регуляторным реакциям внутриклеточного протеинфосфорилирования имеют Са-КМ-зависимые протеинкиназы, аденилатциклаза, фосфодиэстераза циклических нуклеотидов и КМ-зависимая протеинфосфатаза.
На первый взгляд, способность КМ во многих тканях активировать системы как синтеза, так и деградации цАМФ выглядит парадоксом. Однако локализация ферментов аденилатциклазы в мембране, а фосфодиэстеразы в интозоле обусловливает преимущественную Са-активацию аденилатциклазы. Кроме того, для полной активации аденилатциклазы достаточно комплекса КМ-Са+, а для фосфодиэстеразы необходимо заполнение третьего, а возможно, и четвертого Са-связывающего участка КМ. Это означает, что аденилатциклаза активируется при более низких концентрациях Са+.
Результатом действия Са+ и кальмодулина часто является фосфорилирование, катализируемое Са-КМ-зависимыми протеинкиназами. К настоящему времени обнаружено 3 тина КМ-зависимых протеинкиназ В, которые в порядке убывания молекулярной массы обозначаются как протеинкиназы В I, II и III. Основные различия этих типов протеинкиназы В относятся к их субстратной специфичности. Так, протеинкиназа В I типа фос-форилирует лишь несколько белков в нервной ткани, в то же время для киназы II типа только в головном мозге найдено более 10 субстратов. Сродство этих протеинкиназ к КМ практически одинаково, что свидетельствует об одинаковой структуре КМ-узнающего участка фермента.
В нервной ткани, где концентрация Са-КМ-зависимых протеинкиназ особенно высока, обнаружены специфические изоферменты В-киназ I и II типа. Так, в мозге быка найдено, по меньшей мере, 3 изофермента В-киназы I типа. Высокомолекулярные олигомерные В Н-киназы из лобных долей мозга и мозжечка отличаются по субъединичному составу. Если первый фермент состоит из субъединиц а и р с Мг = 50/55 и 60/65 кД в молярном соотношении 3:1, то В-киназа из мозжечка имеет другое соотношение этих субъединиц - 1:4. Гетерогенность и высокая концентрация В-киназ в нервной ткани может обусловливать физиологическую значимость Са-КМ-зависимого фосфорилирования в клетках нервной системы.
Как установлено, протеинкиназа В II типа составляет примерно 0,4% от общего белка головного мозга млекопитающих, что свидетельствует о важной регуляторной роли фермента в этом отделе ЦНС. В-киназа II типа преимущественно связана с мембранной фракцией в отличие от "цитоплазматической" киназы В I типа. Мембраносвязанный фермент II типа сконцентрирован в области постсинаптического уплотнения в тех отделах нервной системы, которые связаны с обучением. Киназа В II типа обладает свойствами двухфазного переключателя со стабильностью, необходимой для кодирования долговременной памяти.
КМ-зависимые протеинкиназы могут быть разделены на 2 группы по структурным особенностям. Так, в одной группе КМ является интегральной частью фермента, а в другой - способен обратимо диссоциировать от протеинкиназы. Примером первого случая может служить киназа фосфорилазы, [Три активации фермента Са+ связывается с субъединицей фермента, являющейся кальмодулином. Около 20 лет назад было обнаружено стимулирующее действие на киназу фосфорилазы протеинкиназы А. К настоящему времени установлено, что 10-20 кратное увеличение активности фермента может быть вызвано цГМФ-зависимой и КМ-зависимой протеинкиназами. Участие экзогенного КМ в регуляции активности киназы фосфорилазы происходит только при отсутствии стимулов, приводящих к увеличению внутриклеточного содержания цАМФ. Гликоген и ферменты его метаболизма присутствуют в глии и нейронах: электростимулируемое расщепление гликогена в нервной ткани регулируется посредством активации киназы фосфорилазы.
Киназа легких цепей миозина является представителем второй группы КМ-зависимых протеинкиназ. Регуляция с помощью КМ-киназы легких цепей миозина осуществляется по принципу "все или ничего". Так, в отсутствие КМ фермент практически не активен, а при действии комплекса Са-КМ его активность возрастает в 200-300 раз. Установлено, что АТФазная активность актомиозина мозга увеличивается в 2-3 раза при фосформировании миозина киназой легких цепей.
Как упоминалось, активность КМ-зависимых протеинкиназ модулируется аутофосфорилированием. Аутофосфорилирование 2 субъединиц киназы фосфорилазы приводит к значительному увеличению ее активности. Аутофосфорилирование регулирует также компартментализацию В-киназ в нервных клетках, как это показано на нейронах аплизии. В присутствии комплекса Са-кальмодулин или цАМФ происходит транслокация активности В-киназы в цитозоль из мембраноцитоскелетной фракции. В-киназа тесно ассоциирована с определенными белками цитоскелета и мембран: фосфорилирование этих белков, как показано на препаратах мозга крыс, приводит к ослаблению сродства В-киназ к мембранам и цитоскелету.
Очевидно, что изменения в содержании цитоплазматического Са+ имеют множественные последствия для синаптической функции, особенно для экзоцитоза. Мишенью ряда регулирующих экзоцитоз лекарственных препаратов и антител может быть кальмодулин. Установлено, что запускаемая деполяризацией секреция вазопрессина и окситоцина из нервных терминалей гипофиза является Са-зависимой и не требует участия цАМФ или протеинкиназы С, причем комплекс Са - кальмодулин связывается с белками мембран секреторных гранул, представляющими собой, вероятно, субъединицы специфичной протеинкиназы. Следствием этого процесса является усиление экзоцитоза посредством слияния мембран секреторных гранул с цитоплазматической мембраной.
В секреции нейромедиаторов принимают участие протеинкиназы В I и II типа, а также протеинкиназы А и С. Взаимодействие этих протеинкиназ отчетливо проявляется при фосфорилировании синапсинов - специфических белков синаптических структур. Один из этих белков - синапсин I, составляющий 6% от общего белка высокоочищенных синаптических везикул и являющийся своеобразным "мостиком" между везикулами и цитоскелетом, фосфорилируется протеинкиназой В I типа и протеинкиназой А по одному остатку серина. Два других остатка серина в молекуле синапсина I фосфорилирует протеинкиназа В II типа и, вероятно, протеинкиназа С. В нейронах найден так называемый протеин-Ш - белок, также связанный с синаптическими мембранами и по ряду свойств напоминающий синапсин I. Протеин-Ш по единственному остатку серина фосфорилируют как протеинкиназа А, так и протеинкиназа В I типа. Очевидно, цАМФ- и Са-зависимое фосфорилирование синапсина I и протеина-III обеспечивает регуляцию секреции нейромедиаторов. Так, инъекция в синапс В-киназы II типа увеличивает секрецию, в то время как инъекция дефосфорилированного синапсина I угнетает высвобождение нейромедиаторов. Для эффективной секреции необходимо одновременное фюсфорилирование синапсина I А-, В- и С-киназами. Секреция нейромедиаторов регулируется, по-видимому, разрывом связи фосфорилированного синапсина I с актином и тубулином. В результате везикулы высвобождаются из комплекса с белками цитоскелета и становится возможной Са-индукция экзоцитоза. Предполагается также, что сконцентрированные в синаптических окончаниях молекулы В-киназы II типа сами по себе являются стерическим препятствием для высвобождения медиаторов из секреторных везикул. Аутофосфорилирование киназы способствует ее диссоциации на субъединицы и, таким образом, стимулирует секрецию.
Важную роль в функционировании нейронов играет совместное фосфорилирование протеинкиназами А II типа и В II типа высокомолекулярного белка МАР-2, сконцентрированного в дендритах нейронов. Как упоминалось, именно здесь локализована Р-субъединица А-киназы II типа, которая обладает высоким сродством к МАР-2 и является своеобразным "якорем" цАМФ-зависимой фосфорилирующей активности в дендритах. МАР-2 участвует в сборке микротрубочек: фосфорилирование этого белка киназами В и АII типа контролирует процесс сборки и, таким образом, может модулировать функциональную активность нейронов. МАР-2 фосфорилирует также протеинкиназа С; роль этого процесса в функционировании нейронов выясняется.
Предполагается, что комплекс МАР-2 - Р-субъединица А-киназы II типа может изменять проницаемость мембран нейронов для Na+ и К+ без фосфорилирования К-субъединицей киназы. Возможно, сигналом для такого изменения мембранной проницаемости является взаимодействие цАМФ с Р-субъединицей протеинкиназы II типа, ассоциированной с МАР-2. Сигнал распространяется по цитоскелету к мембране нейронов с очень высокой частотой; для поддержания такой частоты достаточное время требуется энергия АТФ.
Синергизм в действии протеинкиназ В и А в нервной ткани проявляется также при потенцировании цАМФ-индуцируемых входящих токов внутриклеточными ионами Са. Повышение внутриклеточной концентрации цАМФ в нейронах виноградной улитки приводит к деполяризации мембраны, а в условиях фиксации потенциала - к возникновению ионного тока по каналам пассивной проницаемости. Увеличение внутриклеточной концентрации Са+ приводит к значительному увеличению амплитуды и длительности цАМФ-тока.
Можно полагать, что синергическое действие Са+ и иАМФ на соответствующие ионные каналы связано с наличием у последних двух различных участков фосфорилирования; для В- и А-киназ. Возникающие под влиянием КМ-зависимого фосфорилирования изменения в структуре канала обеспечивают повышение доступности соответствующего участка фосфорилирования для протеинкиназы А. Напротив, при изучении влияния внутриклеточного Са+ на Са-зависимые калиевые каналы взаимодействие двух систем вторичных посредников отличается тем, что цАМФ выступает в роли агента, повышающего чувствительность канала к внутриклеточному Са+ и КМ. Можно полагать, что регуляция числа каналов и их активности с помощью протеинфосфорилирования связана с изменениями в процессах поведения и обучения.
В последнее время появились данные о регуляции протеинкиназной и протеинфосфатазной активности с помощью Са-связывающего белка S-100. S-100 активирует фосфопротеинфосфатазы мозга, а также модулирует активность ядерных и цитоплазматических протеинкиназ этой ткани, в частности К-субъединицы протеинкиназы A. S-100 ингибирует фосфорилирование ряда субстратов в клетках мозга; кальмодулин активирует фосфорилирование этих же белков. Возможно, S-100 и кальмодулин действуют в мозге как антагонисты. Во всяком случае, в нервной ткани реализуется еще один путь Са-зависимого фосфорилирования-дефосфорилирования, независимый от КМ-стимулируемого процесса. S-100-стимулируемое фосфорилирование-дефосфорилирование может принимать участие в регуляции ряда функций нервных клеток.
Необходимо отметить участие В-киназы II типа наряду с протеинкиназой А в фосфорилировании и соответствующей активации т! фозингидроксилазы, что приводит к ускорению синтеза катехоламинов в ответ на нервный импульс и нейромедиаторный сигнал. Установлено, что тршггофангидроксилаза - фермент, катализирующий первую реакцию биосинтеза серотонина, также фосфорилируется протеинкиназой В II типа. Фосфорилирование триптофангидроксилазы приводит к двукратному увеличению ее активности. Таким образом, Са-КМ-зависимое фосфорилирование ферментов, принимающих участие в синтезе нейромедиаторов и гормонов, является одним из ключевых аспектов участия В-киназ в нейрогуморальной регуляции.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
