Принципы биохимических исследований - рефераты, скачать рефераты, бесплатно рефераты

Рефераты. Принципы биохимических исследований

граничения метода.

Высокая концентрация ионов аммония в осадке может мешать точному определению концентрации белка.

Высаливаются не только белки, но и, например, детергенты. Например, 0.5% Tween 20 и Triton X100 начинают агрегировать при концентрациях сульфата аммония больше 1M. Образующийся преципитат имеет плотность чуть меньше плотности солевого раствора. При центрифугировании он всплывает, прихватывая с собой белки.

Осаждение сульфатом амония нельзя использовать для белков, требующих присутствия Ca2+ из-за нерастворимости сульфата кальция.

Лекция 4. Буферные растворы и специальные добавки. Ультрафильтрация. Диализ. Детергенты и их применение
Буферные растворы (синоним: буферные смеси, буферные системы, буферы) - растворы с определенной концентрацией водородных ионов, содержащие сопряженную кислотно-основную пару, обеспечивающую устойчивость величины их водородного показателя при незначительных изменениях концентрации либо при добавлении небольшого количества кислоты или щелочи.

Кислотно-основная пара Б. р. представляет собой слабую кислоту и ее соль, образованную сильным основанием (например, уксусная кислота СН3СООН и ацетат натрия CH3COONa) или слабое основание и его соль, образованную сильной кислотой (например, гидроокись аммония NH4OH и хлористый аммоний NH4CI). При разведении раствора или добавлении к нему некоторого количества кислоты или щелочи кислотно-основная пара способна соответственно быть донором либо акцептором водородных ионов, поддерживая Т.о. величину водородного показателя на относительно постоянном уровне.

Буферные растворы сохраняют устойчивость буферных свойств в определенном интервале значений рН, то есть обладают определенной буферной емкостью. За единицу буферной емкости условно принимают емкость такого буферного раствора, для изменения рН которого на единицу требуется добавить 1 моль сильной кислоты или сильной щелочи на 1 л раствора. Буферная емкость находится в прямой зависимости от концентрации Б. р.: чем концентрированнее раствор, тем больше его буферная емкость; разведение Б. р. сильно уменьшает буферную емкость и лишь незначительно изменяет рН.

Тканевая жидкость, кровь, моча и другие биологические жидкости являются буферными растворами. Благодаря действию их буферных систем поддерживается относительное постоянство водородного показателя внутренней среды, обеспечивающее полноценность метаболических процессов. Наиболее важной буферной системой является бикарбонатная система крови. Концентрация в крови бикарбонатов служит одним из основных показателей кислотно-щелочного состояния организма. Этот показатель позволяет установить характер нарушения кислотно-щелочного равновесия при ряде патологических процессов.

В лабораторной практике Б. р. используют в тех случаях, когда то или иное исследование может быть проведено лишь при постоянном значении рН (например, определение активности ферментов, изучение кинетики ферментативных реакций, электрофоретическое разделение белковых смесей и др.) и в качестве стандартов при определении рН различных растворов, в т. ч. биологических жидкостей.

Буферные растворы готовят обычно путем растворения в воде взятых в соответствующих пропорциях слабой кислоты и ее соли, образованной щелочным металлом, частичной нейтрализации слабой кислоты сильной щелочью или слабого основания сильной кислотой, растворения смеси солей многоосновной кислоты.

Лекция 5. Общие принципы хроматографии, классификация хроматографических методов
Всем хроматографическим методам присущи некоторые общие характеристики, позволяющие ниже изложить элементы их обобщенной теории. Однако сначала рассмотрим специфические особенности различных вариантов хроматографического фракционирования. Это, с одной стороны, позволит за теоретическими рассуждениями все время видеть реальные черты хроматографического эксперимента, а с другой - даст возможность ввести классификацию хроматографиче-ских методов. В ходе дальнейшего изложения (в частности, для его разбиения по главам) удобнее всего классифицировать методы по основному принципу фракционирования. Такую классификацию мы рассмотрим достаточно подробно и лишь в конце раздела кратко отметим другие возможные варианты классификации.

КЛАССИФИКАЦИЯ ПО ПРИНЦИПУ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ.

Как уже упоминалось, в любом хроматографическом процессе фигурируют неподвижная и подвижная фазы, между которыми распределяются молекулы фракционируемой смеси веществ. Под основным принципом фракционирования будем подразумевать природу физического, химического или биологического явления, обусловливающего такое распределение.

КЛАССИФИКАЦИЯ ПО СПОСОБУ ЭЛЮЦИИ.

Фронтальный анализ.

Так называется вариант хроматографического процесса, когда раствор смеси компонентов непрерывно подается на вход хроматографической колонки. На выходе ее в этом случае появляются один за другим несколько "фронтов" элюата. За первым из них следует чистый, быстрее других мигрирующий в данной системе компонент смеси, отличающийся, очевидно, наименьшим сродством к неподвижной фазе. Второй фронт отмечает добавление к нему следующего по подвижности компонента. За третьим фронтом следует уже смесь трех компонентов. В настоящее время по вполне понятным причинам фронтальный анализ почти вышел из употребления и применяется лишь в отдельных, специальных случаях.

Вытеснительная хроматография.

В этом варианте в колонку или на стартовую линию хроматографической пластинки наносят определенную порцию раствора исходной смеси веществ, а затем ведут элюцию раствором вещества, обладающего заведомо большим сродством к неподвижной фазе хроматографической системы, чем любой из компонентов смеси. Происходит вытеснение их из неподвижной фазы, причем в первую очередь тех, которые обладают меньшим сродством к сорбенту, а затем и всех остальных. Элюент выталкивает все компоненты смеси впереди себя наподобие поршня. Так как они выходят в подвижную фазу концентрированными, то между ними также идет конкуренция за связь с неподвижной фазой. Компоненты, уступающие другим в силе сродства к этой фазе, оттесняются еще вперед, где сорбируются, но только до тех пор, пока их опять не вытеснят компоненты, обладающие большим сродством к сорбенту. В результате такого чередования сорбции и вытеснения компоненты смеси будут выходить из колонки один за другим в порядке возрастания силы их связи с неподвижной фазой. Ясно, что при этом зоны соседних компонентов будут соприкасаться или даже немного перекрываться друг с другом. Для аналитического фракционирования метод непригоден, но хорош для препаративного или полупромышленного разделения веществ, поскольку емкость колонки здесь используется очень эффективно.

Хроматографическая элюция.

В отличие от предыдущего в этом методе элюирующий раствор обладает меньшим сродством к сорбенту, чем любой из компонентов вносимой на колонку или пластинку смеси веществ. Эти компоненты постепенно "вымываются" из неподвижной фазы и движутся вдоль колонки за счет непрерывного перераспределения их молекул между неподвижной фазой и элюентом. Каждый из них мигрирует независимо от других в соответствии с соотношением сил его сродства к неподвижной и подвижной фазам. Миграция идет тем медленнее, чем больше сродство к неподвижной фазе. Именно этот, пригодный для аналитических целей вариант хроматографии подробно рассмотрен в следующем разделе, поэтому здесь можно ограничиться указанием на то, что при хроматографической элюции компоненты смеси выходят из колонки отдельными, разделенными друг от друга зонами, которые в соответствии с типичной формой профиля распределения вещества в каждой такой зоне (см. ниже) часто называют хроматографическими пиками.

КЛАССИФИКАЦИЯ ПО РАСПОЛОЖЕНИЮ НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ.

Эта классификация не требует особых пояснений. Если пористые гранулы геля или сорбента для любого типа хроматографии заполняют стеклянную или металлическую колонку, то говорят о хроматографии на колонке, или "колоночной хроматографии", хотя последнее выражение относится к категории укоренившегося жаргона. Хроматографию на колонке во многих случаях теперь ведут при очень большом давлении подачи элюента (до 300-400 атм), что позволяет уменьшить диаметр гранул до 5-10 мкм с вытекающими отсюда (см. ниже) существенными преимуществами в быстроте и качестве фракционирования микроколичеств исходного вещества. За это приходится расплачиваться использованием дорогостоящих стальных прецизионных колонок и специальной аппаратуры, но в случае серийных анализов такие затраты себя оправдывают. Жидкостную Хроматографию на колонках при высоком давлении условимся сокращенно обозначать ЖХВД. В английской литературе принято обозначение HPLC, которое расшифровывают как "high pressure (иногда - Align performance) liquid chromatography".

Если хроматографический процесс идет в наклонно расположенном, ровном и относительно толстом (несколько миллиметров), открытом с поверхности слое гранул, между которыми жидкость подвижной фазы течет только под действием силы тяжести, то его можно назвать хроматографией в толстом слое" Практически этот метод нашел себе применение только для гель-фильтрации.

Тонкий (0,1-0,5 мм) слой гранул, адсорбированных или иным образом закрепленных на поверхности пластинки из стекла или пластика, позволяет осуществлять Хроматографию в тонком слое, или "тонкослойную Хроматографию" (ТСХ). Английское обозначение TLC (thin layer chromatography). Движение жидкой фазы происходит за счет капиллярных сил.

Вместо тонкого слоя сорбента на основе целлюлозы можно использовать просто фильтровальную бумагу, иногда специальную - с введенными в нее ионогенными группами. Соответствующий процесс следует называть хроматографией на бумаге.

Вместо бумаги для аналогичного типа хроматографии используют пленки из модифицированной целлюлозы, полиамидные пленки и т.д. - это варианты хроматографии на пленках,

Пластинки, бумага или пленка могут располагаться горизонтально или вертикально; в последнем случае движение подвижной фазы может быть восходящим или нисходящим - это не играет принципиальной роли, так как оно обусловлено в основном капиллярными силами. Препараты на пластинки или бумагу чаще всего наносят в виде полоски или пятна раствора у одного края сорбента, неподалеку от уровня элюирующей жидкости, в которую этот край погружают. В последнее время для ТСХ все чаще применяют вариант кольцевой хроматографии, когда исходный препарат наносят в виде кольца, а элюция идет радиально.

Лекция 6. Материалы матриц сорбентов и обменников. Техника колоночной хроматографии
Матрицей называют твердую основу неподвижной хроматографической фазы. Она имеет вид сплошных или пористых гранул; последние часто представляют собой пространственную сетку линейных полимеров. Для придания материалу матрицы необходимых для хроматографии свойств его модифицируют. Модификация может представлять собой химическое присоединение ("присадку") ионогенных групп, гидрофобных молекул, биологически активных веществ или фиксацию путем адсорбции тонкого слоя растворителя. Хотя особенности хроматографического процесса определяются в основном характером модификации, физико-химические параметры матрицы могут существенно влиять на свойства неподвижной фазы. К таким параметрам относятся следующие: размеры и форма гранул и их пор; диапазон разброса этих размеров; механическая прочность материала матрицы; характер его смачивания и набухания в элюенте; химическая стойкость и инертность в условиях хроматографической элюции; реакционная способность, обеспечивающая возможность химической модификации матрицы.

Одни и те же матрицы, по-разному модифицированные, могут образовывать неподвижную фазу для разных хроматографических методов, поэтому во избежание повторений в данной главе мы познакомимся с физико-химическими свойствами всех применяемых в настоящее время матриц, а их модификации (а также свойства и номенклатуру получаемых путем этих модификаций сорбентов) рассмотрим в последующих главах, посвященных различным методам хроматографии. Прежде чем перейти к анализу свойств различных матриц, укажем общие для них способы обозначения диапазона линейных размеров гранул (а для сфер - их диаметров). Этот диапазон указывают либо непосредственно в микронах, либо в виде интервала чисел "МЕШ" ("mesh"). Число МЕШ соответствует числу нитей на дюйм в сетке с квадратными ячейками, через которую просеиваются гранулы. С учетом толщины самих нитей это означает, что через сетку в 100 МЕШ пройдут все гранулы, максимальный размер которых меньше 160 мкм, через сетку в 200 МЕШ - меньше 80, 400 МЕШ - меньше 40. Таким образом, диапазон размеров гранул 40-80 мкм соответствует 200-400 МЕШ. В него попадут гранулы, которые просеиваются через сетку в 200 МЕШ, но не проходят через ячейки сетки в 400 МЕШ. Для мелких гранул, размер которых менее 40 мкм, принято обозначение - 400 МЕШ.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7