Принципы биохимических исследований - рефераты, скачать рефераты, бесплатно рефераты

Рефераты. Принципы биохимических исследований

омимо равновесий Э. м. позволяют исследовать кинетику комплексообразования, используя явление дополнит. квазидиффузионного размывания под действием электрич. поля первоначально узкой зоны, содержащей разл. ионные формы с разными знаками заряда. Для достижения этого эффекта необходимо приложить поле такой напряженности, чтобы скорость электромиграц. переноса ионов превышала скорость протекания комплексообразования.

Для изучения кинетики р-ций можно использовать также зонную электромиграцию ионов в неравновесном с ними электролите. В обоих случаях применение Э. м. целесообразно при анализе процессов, скорость к-рых лежит в пограничной области между медленными и быстрыми р-циями.

Закономерности электромиграции ионов в расплавах солей исследованы в значительно меньшей степени, чем в водных р-рах. Обычная среда при проведении электромиграции в расплавленных солях - безводные расплавы нитратов и перхлоратов щелочных металлов или эвтектич. смеси, имеющие сравнительно низкую т-ру плавления.

Для электромиграции в расплавах характерны две осн. проблемы: сильное взаимод. ионов изучаемых металлов и расплавленной соли; отсутствие электрически нейтрального р-рителя, для к-рого можно измерить истинную скорость движения ионов. Поэтому обычно их подвижность определяют относительно прибора, в к-ром проводят электромиграцию. В этом случае данные о подвижности в расплавах смещены на неизвестную постоянную величину.

Лекция 14. Изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез
Фокусирующий ионный обмен. Этот метод часто наз. электрофоретич. фокусировкой или просто электрофокусированием, связан с наложением градиента концентрации или рН р-ра параллельно электрич. полю. Благодаря этому разделяемые ионы могут изменять величину и знак заряда по мере перемещения в поле градиента. При этом в фиксир. точках системы каждый компонент переходит в изоэлектрич. состояние, в к-ром ср. заряд частиц данного компонента равен нулю. Упомянутые точки являются местом концентрирования (фокусирования) отдельных компонентов смеси (рис.5). Положение зон фокусирования определяется градиентом концентрации комплексообразующего реагента или рН р-ра и константами устойчивости комплексных ионов разделяемых элементов. При разделении смеси белков или др. амфотерных соед. положение зон определяется значениями их изоэлектрич. точек.

Для создания градиента рН электродные камеры заполняются буферными р-рами с разными значениями рН. Напр., для разделения редкоземельных элементов цериевой группы в 0,001 М р-ре этилендиаминтетрауксусной к-ты рН должен изменяться по длине колонки от 1,7 у анода до 2,4 у катода.

В сер.60-х гг.20 в. было предложено создавать градиент рН с помощью амфолитов - смесей алифатич. полиаминокислот. Под влиянием электрич. поля амфолиты распределяются в соответствии со своими изоэлекгрич. точками и тем самым образуют градиент рН. Применение амфолитов позволяет добиться весьма высокой разрешающей способности метода: в нек-рых случаях удается разделить белки, изоэлектрич. точки к-рых различаются на 0,02 единицы рН.

Схема, поясняющая метод электрофокусирования: а - образование градиента концентрации лиганда [А] ; б - распределение ионных форм мигранта; в - концентрирование лиганда в узкой зоне; см - концентрация мигранта.

Описанный метод, являясь самостоятельным, в то же время представляет собой вариант зонного электрофореза. Во всех модификациях последнего идентификацию и количеств. определение в-в в зонах можно проводить как непосредственно на носителе, так и после элюирования. В обоих случаях используют методы радиоактивных индикаторов, фотометрию в прямом и отраженном свете, люминесцентный анализ.

Фронтальные методы основаны на измерении скорости перемещения границы раздела р-ров с разной плотностью. Классич. вариант метода был разработан в 1930 и с тех пор применяется для определения подвижности и разделения высокомол. в-в, в частности белков. В простейшей модификации метода в U-образную трубку помещают р-р белков, а над ним буферный электролит, в к-рый погружены электроды. При наложении электрич. поля индивидуальные белки перемещаются с разл. скоростями, образуя серию границ. Их положение регистрируют оптич. методами по изменению коэф. преломления.

Изотахофорез. Осн. частью прибора служит капиллярная трубка с анодным и катодным резервуарами на концах. При анализе анионов анодное отделение и капилляр заполняют т. наз. лидирующим электролитом, содержащим анион с высокой подвижностью. Ср. скорость миграции анионов в этом электролите должна быть выше подвижности любого аниона в исследуемой смеси. Катодное отделение заполняют т. наз. замыкающим электролитом, анион к-рого имеет подвижность меньшую, чем подвижность любого др. аниона в смеси. Анализируемый образец, в к-ром нужно определить содержание анионов, вносят между предшествующим и замыкающим электролитами. После подачи напряжения (5-10 кВ) при силе тока до 100 мкА по мере движения анионов к катоду постепенно образуются зоны индивидуальных анионов определенной длины, разделенные четкими границами, ширина к-рых составляет 0,2-0,3 мм при диаметре капилляра 0,1 мм. После этого все зоны будут перемещаться с одинаковой скоростью (отсюда назв. метода). Соотношение концентраций анионов в двух соседних зонах с1 и с2 в установившемся режиме будет определяться выражением Кольрауша:

с1/с2 = n1/n2, (4)

где n1и n2 - числа переноса.

При анализе катионов лидирующий электролит должен содержать катионы с высокой подвижностью, замыкающий - с миним. для данной системы скоростью миграции.

Кол-во в-ва в зоне Q и ее длина l в капилляре постоянного сечения S связаны простым соотношением:

Q = ClS, (5)

где С - коэф. пропорциональности.

В установившеся режиме градиент потенциала при переходе от лидирующего к замыкающему электролитам скачкообразно возрастает в соответствии с подвижностью ионов, составляющих данную зону. Это приводит к температурным скачкам между зонами, регистрируя к-рые с помощью термопары можно определить расстояние между зонами и по выражению (5) найти кол-во в-ва в зоне.

Лекция 15. Обнаружение, количественное определение и характеристика макромолекул после электрофореза
На электрофоретически разделенные антигены наносят иммунные сыворотки, содержащие различные специфические антитела. При встрече соответствующих антигена и антитела в зоне оптимального их соотношения наблюдается реакция преципитации невооруженным глазом. Иммунный электрофорез объединяет преимущества электрофореза и иммунной реакции: высокая разрешающая способность метода, разделяющая компоненты анализируемой системы на основе электрофоретической мобильности и высокая специфичность иммунных антисывороток.

Лекция 16. Принцип иммунного электрофореза. Иммунофиксация
Электрофорез с иммунофиксацией (JFE) - это двухступенчатый процесс, использующий электрофорез протеинов на первом этапе и иммунопреципитацию на втором. При этом исследованию может быть подвергнута сыворотка крови, моча, спинномозговая или другая жидкость организма. Электрофорез с иммунофиксацией - один из современнейших методов в кинической лаборатории для получения характеристик моноклональных иммуноглобулинов. Моноклональная гаммопатия характеризуется неконтролируемой пролифирацией одного клона плазменных клеток за счет других клеток. Эта дисфункция часто приводит к синтезу большого количества одного иммуноглобулина или его субъединицы со снижением нормальных уровней иммуноглобулинов. При этом на электрофореграмме выявляется один резко увеличенный пик в бета-гамма-области.

Лекция 17. Электросинерез. Электроиммуноанализ
Перекрестный иммуноэлектрофорез.

Информацию о равновесных процессах в р-ре получают при изучении зависимости скорости миграции ионов исследуемого элемента от концентрации одного или неск. участвующих в р-ции в-в. По этой зависимости можно выявлять состав продуктов р-ции и определять константы равновесия. В случае р-ций комплексообразования изучаемый металл М может находиться одновременно в неск. ионных формах связи с лигандом А, между к-рыми устанавливается подвижное равновесие. В такой системе общее, или суммарное, перемещение в электрич. поле всех ионов, содержащих М и имеющих индивидуальные подвижности иi, происходит с нек-рой ср. скоростью ис, характеризующей суммарный электромиграц. перенос металла в единицу времени:

где i - число лигандов в комплексе;

- доля металла, связанного в i-ую ионную форму;

- полная константа устойчивости ионной формы; [М], [А] и [МАi] - соотв. равновесные концентрации металла, лиганда и комплекса.

Кривая электромиграции (рис.1), отражающая смещение подвижного равновесия между разл. ионными формами при изменении равновесной концентрации лиганда, устанавливает области существования: своб. ионов (I); координационно ненасыщенных форм (II); координационно насыщенных комплексных ионов (III).

Состав комплексных ионов можно определять неск. приемами: по эмпи-рич. зависимости между подвижностью ионов и величиной их заряда; из соотношения общей и равновесной концентраций лиганда, к-рое определяется по скорости электромиграции введенного в систему вспомогат. металла (по ур-нию 2); по соотношению между коэф. диффузии и подвижностью при одной и той же концентрации лиганда.

Константы устойчивости ионных форм рассчитывают путем решения системы из п ур-ний вида (2), где п равно числу ионных форм.

Лекция 18. Методы меченых атомов
ИЗОТОПНЫЕ ИНДИКАТОРЫ, в-ва, имеющие в своем составе хим. элемент с изотопным составом, отличающимся от природного. Часто И. и. называют сами изотопы-метки, добавляемые в в-во, содержащее прир. смесь изотопов данного элемента. Т.к. поведение изотопов одного элемента в физ. - хим. процессах практически идентично (за исключением легких элементов с атомными номерами Z = 10-12, для которых относительно большую роль могут играть изотопные эффекты), использование И. и. позволяет по регистрации изотопа-метки исследовать самодиффузию и миграцию меченого в-ва, определять ничтожно малые кол-ва в-ва, изучать механизмы хим. р-ций и биол. процессов (т. наз. метод изотопных индикаторов, ранее наз. методом меченых атомов).

Лекция 19. Спектрофотометрические методы анализа
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ, метод исследования и анализа в-в, основанный на измерении спектров поглощения в оптич. области электромагн. излучения. Иногда под С. понимают раздел физики, объединяющий спектроскопию (как науку о спектрах электромагн. излучения), фотометрию и спектрометрию [как теорию и практику измерения соотв. интенсивности и длины волны (или частоты) электромагн. излучения] ; на практике С. часто отождествляют с оптич. спектроскопией. По типам изучаемых систем С. обычно делят на молекулярную и атомную. Различают С. в ИК, видимой и УФ областях спектра (см. Инфракрасная спектроскопия, Ультрафиолетовая спектроскопия).

Применение С. в УФ и видимой областях спектра основано на поглощении электромагн. излучения соединениями, содержащими хромофорные (напр., С = С, С=С, С=О) и ауксохромные (ОСН3, ОН, NH2 и др.) группы (см. Цветность органических соединений}. Поглощение излучения в этих областях связано с возбуждением электронов s-, p-и n-орбиталей осн. состояния и переходами молекул в возбужденные состояния: s:--s*, n: s*, p: p* и n: p* (переходы перечислены в порядке уменьшения энергии, необходимой для их осуществления; см. также Молекулярные спектры). Переходы s: s* находятся в далекой УФ области, напр. у парафинов при ~ 120 нм. Переходы n: s* наблюдаются в УФ области; напр., орг. соед., содержащие n-электроны, локализованные на орбиталях атомов О, N, Hal, S, имеют Полосы поглощения при длине волны ок. 200 нм. Линии, соответствующие переходам p: p*, напр., в спектрах гетероциклич. соединений проявляются в области ок.250-300 нм и имеют большую интенсивность. Полосы поглощения, соответствующие переходам n: p*, находятся в ближней УФ и видимой областях спектра; они характерны для соед., в молекулах к-рых имеются такие хромофорные группы, как С = О, C = S, N = N. Так, насыщ. альдегиды и кетоны имеют максимумы поглощения при длине волны ок.285 нм. Переходы типа n: p* часто оказываются запрещенными, и соответствующие полосы поглощения обладают очень малой интенсивностью.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7