Одним из способов изучения путей превращения введенного соединения in vivo является перфузия органов (например, почек или печени), при которой соединение вводят с помощью тонкой полой иглы в артерию, несущую кровь к данному органу, а затем анализируют пробы крови, взятые из соответствующей вены животного.
В Англии существуют инструкции, ограничивающие применение живых позвоночных животных для исследовательских целей; контроль за выполнением этих инструкций осуществляется специальными комиссиями Внутреннего департамента (Министерства внутренних дел Великобритании). Эксперименты на живых позвоночных нельзя проводить без особого разрешения министерства, которое должно быть подписано профессором физиологии (или специалистом смежного профиля) и президентом Королевского общества или его заместителем.
Для изучения распределения введенного соединения животное спустя некоторое время после инъекции умерщвляют с помощью анестезий, декапитации или цервикальной дислокации. Затем проводят исследования либо трупа животного, либо отдельных органов, которые для этой цели изолируют, выявляют морфологические изменения, происшедшие в них, изучают их составные части.
Для получения наглядного представления о распределении введенных мелким лабораторным животным радиоактивных соединений успешно применяется метод авторадиографии препаратов целого организма (разд. 6.2.4). Этот метод позволяет получить данные о распределении и относительном содержании введенного соединения в тканях животного, скорости его выведения и способности проникать сквозь биологические мембраны. Через определенный промежуток времени после введения соединения животное умерщвляют с помощью анестезии и быстро замораживают смесью ацетона с твердым С02 при температуре --78° С или с помощью жидкого азота. Замороженное животное помещают при низкой температуре в водный раствор смолы (аравийская камедь), а после застывания смолы рассекают на соответствующем уровне резцом, прикрепленным к электродрели, или делают секционные срезы с помощью микротома со специальным лезвием из карбида вольфрама. Полученный срез прикладывают к рентгеновской пленке и оставляют на 1--2 нед при низкой температуре, после чего пленку проявляют. Сопоставляя полученную авторадиограмму с цветным снимком среза, изучают распределение и локализацию введенного животному изотопа в различных его органах и тканях. Типичная авторадиограмма изображена на рис. 1.3.
4. Изотонические солевые растворы
При проведении экспериментов на органах животных, срезах растительных и животных тканей, гомогенатах и клеточных органеллах необходимо, чтобы среда для суспендирования имела не только определенный рН, но и заданный ионный состав. Среда должна быть изотонической, т. е. осмотическое давление в ней должно совпадать с осмотическим давлением внутри клетки или клеточной органеллы, чтобы их метаболическая целостность не нарушалась. Кроме того, если, например, изучают рост клеток, среда для суспендирования должна содержать все необходимые основные питательные вещества. Это требование нужно особенно тщательно выполнять при изучении культур клеток и тканей, особенно культур животных клеток.
Существует целый ряд физиологических солевых растворов, многие из которых являются разновидностями одного из первых -- раствора Рингера. К ним относятся растворы Тайрода, Янга, Лока, Менга и Да Жалона. Наиболее часто применяются фосфатный и бикарбонатный растворы Кребса--Рингера. По своему ионному составу бикарбонатный солевой раствор близок к сыворотке крови млекопитающих. Фосфатный раствор Кребса--Рингера не является физиологическим, но может с успехом применяться для изучения срезов и гомогенатов тканей в тех случаях, когда поглощение кислорода измеряют манометрическими методами (разд. 8.6.2). Большинство этих солевых растворов содержат в различных количествах NaCl, КС1, MgS04, СаС12, NaHCOs и КН2Р04; некоторые растворы насыщены смесью газов -- кислорода и углекислого газа. Кроме того, в их состав могут входить такие соединения, как глюкоза, пируват, фумарат и оксалоацетат. Для исследования культур животных тканей используются растворы Хэнкса и Гей--Эрля. Выбор того или иного раствора вначале является произвольным и не основывается на объективных данных, поэтому перед его применением необходимо убедиться, что состав его оптимален. И, наконец, при проведении физиологических экспериментов нужно следить за тем, чтобы эффекты, наблюдаемые при изменении рН среды, были вызваны изменениями в концентрации ионов водорода, а не какими-либо другими изменениями буферного раствора.
5. Перфузия изолированных органов
Сущность этого метода заключается в том, что изучаемый орган (печень, почку или сердце) изолируют из организма животного и помещают в специальный термостатируемый прибор. Затем к перфузионной жидкости, которая обычно вводится в орган через артерию, добавляют исследуемое соединение и анализируют жидкость, вытекающую из органа через вену, что позволяет проследить за превращениями введенного соединения. Перфузионную жидкость можно пропускать через орган однократно или несколько раз, самотеком или с помощью небольшого насоса. Насос применяют тогда, когда перфузионную жидкость пропускают через орган многократно. В отдельных случаях жидкость прогоняют не при постоянном давлении, а импульсами, что позволяет приблизить условия опыта к ситуации in vivo и имитирует процесс перекачивания крови сердцем.
Для проведения перфузии не обязательно полностью изолировать орган; ее можно проводить и на органе вскрытого анестезированного животного. При этом удается сохранить интактными нервные волокна и часть сосудистой системы.
Действие какого-либо соединения на ткань или орган (например, гистамина на мышцу) можно изучать по механической ответной реакции изолированной ткани на данное соединение. Исследуемое соединение добавляют к омывающей ткань жидкости; в ответ на это ткань, закрепленная с одного конца, а другим концом связанная с пером самописца, начинает двигаться, и любое движение ткани постоянно регистрируется на самописце. Данный метод позволяет изучать ответную реакцию изолированных органов на введение очень небольших (порядка нескольких нанограмм) количеств активных соединений. Основным недостатком метода перфузии изолированных органов является отсутствие гормонального и нервного контроля; поэтому при экстраполяции всех полученных результатов к ситуации in vivo следует соблюдать осторожность.
6. Приготовление срезов органов и тканей
Срезы тканей желательно делать как можно тоньше, чтобы обеспечить свободный доступ кислорода в самые глубокорасположенные слои срезов и полное выведение продуктов распада за счет диффузии. Этим требованиям удовлетворяют срезы толщиной от 0,5 до 5 мм; кроме того, в этом случае соотношение между разрушенными и интактными клетками остается достаточно малым.
Исследуемый орган извлекают из организма сразу же после умерщвления животного, чтобы посмертные изменения были минимальными. Срезы делают с помощью лезвия бритвы или микротома, затем переносят в сосуд с подходящей средой суспендирования и изучают их метаболизм и действие введенных соединений на обменные процессы. Тканевые срезы часто исследуют манометрическими методами (разд. 8.6.2); при этом, поскольку срезы бывают недостаточно тонкими, для создания аэробных условий и обеспечения кислородом глубокорасположенных слоев клеток приходится применять газовые смеси, содержащие до 95% кислорода. Недостатком данного метода является то, что внешние слои клеток срезов находятся в среде с токсической концентрацией кислорода.
7. Использование растительного материала
Выбор методов при изучении метаболизма у растений определяется в основном степенью организации растения. Одноклеточные и многоклеточные водоросли, например, хорошо растут на простых, чаще всего неорганических питательных средах при соответствующих внешних условиях. Такие водоросли можно рассматривать как интактные организмы; они имеют относительно простое строение и являются удобным экспериментальным материалом для изучения фундаментальных биохимических процессов, которые трудно исследовать на высокоорганизованных растениях. В качестве классического примера можно привести такие растительные организмы, как Scenedesmus и Chlorella, которые используются для изучения фиксации углекислого газа. Эти системы благодаря удобству контроля за их ростом и простоте поставки экзогенных соединений клеткам особенно удобны для изучения действия на обмен веществ таких факторов, как освещение, температура, питание и т. д.
На более высоких уровнях организации -- у высших растений-- доставка экзогенных соединений в соответствующий участок внутри растения в значительной степени затруднена. Если растение растет в почве, исследуемое соединение в виде раствора вносят в эту почву, откуда оно затем всасывается корнями. Другой способ состоит в том, что растение извлекают из почвы и корни помещают в раствор исследуемого соединения на определенный период времени. Раствором соединения можно опрыскивать растение или наносить его непосредственно на листья. Для изучения распределения соединения и его метаболитов внутри растительного организма исследуют отдельные его части -- корни, побеги, листья, почки и цветы.
Основная трудность, возникающая при изучении метаболизма у растений, заключается в том, что в отличие от тканей животных растительные ткани не содержат достаточно крупных и сложных структур. Отдельные части растения можно изолировать, помещать в соответствующую среду, а затем изучать их метаболизм in vitro. Приготовление срезов, дисков, гомогенатов и выделение клеточных органелл из растительных тканей осуществляют такими же способами, как и из тканей животных.
8. Культуры тканей и клеток
Как мы уже говорили, изучение метаболизма на уровне организма или органа связано с целым рядом трудностей. Иногда это обусловлено еще и тем, что некоторые растения содержат очень мало живой ткани, например ткани меристемы, возникают также трудности доставки соединения в определенный участок растения и контроля за ним. Поэтому выращивание тканей и клеток in vitro имеет ряд преимуществ. В соответствующих экспериментальных условиях можно изучать рост, деление и дифференцию клеток, при этом в значительной степени облегчается доставка соединений к клеткам и тканям и изучение их действия. In vitro можно выращивать большие количества той или иной ткани по сравнению с естественным содержанием ее в интактном организме.
Страницы: 1, 2, 3, 4
