После появления признаков роста. из посевов 1 мл переносят в стерильную пробирку и заливают расплавленным агаром температурой не более 45 °С. Пробирку заливают до верха и закрывают пробкой так, чтобы не осталось пузырьков воздуха. Посевы термостатируют 24-48 часов при 37 ± 0,5°С. При обнаружении разрывов в агаре считают, что в посеве присутствуют мезофильные облигатно-анаэробные микроорганизмы (методическое указание, АГТУ,1998).
2.3. Выявление термофильных анаэробных микроорганизмов
( ГОСТ 10444.6)
Метод предназначен: для определения стерильности или промышленной стерильности консервов, предназначенных к реализации в условиях с температурой 30°С и выше; для выяснения причин возникновения дефектов томатопродуктов и консервов с рН выше 4,6.
Сущность метода: выявление в консервах жизнеспособных термофильных анаэробных микроорганизмов размножаться при температуре 55 °С и давать рост на жидких питательных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. В жидких питательных средах Cl. termosaccharolyticum вызывает обильное газообразование, помутнение среды и ее подкисление.
Проведение анализа. Непосредственно перед посевом питательную среду (Китт-Тароцци) регенерируют, прогревая ее 25 мин в кипящей водяной бане и быстро охлаждая до 40 °С.
Для установления промышленной стерильности и при выявлении возбудителей порчи по 2 см3 пробы высевают в две пробирки с 12-13 см3 регенерированной питательной среды (стерильности по 30 см3 в три флакона с 200 см3 питательной среды).
Посевы термостатируют при 55 ±0,5°С в течение 72 часов. Рост уже обнаруживается через 12-14 часов. После появления признаков роста из посевов приготавливают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют.
Термофильные анаэробные микроорганизмы - тонкие длинные гранулированные палочки, которые нерегулярно образуют споры. Окраска по Грамму отрицательная у Cl. termosaccharolyticum, положительная у Cl. termoaceticum и Cl. nigrificans. Из посевов со дна берут пробу дя определения каталазы.
Если в культуре обнаружена каталаза, то в посеве присутствуют аэробные микроорганизмы. Для выделения из смешанной микрофлоры 1-2 мл подозреваемой культуральной жидкости вносят в стерильную пробирку и заливают расплавленным агаром с температурой не выше 47 °С. Пробирку заливают агаром доверха и закрывают пробкой, чтобы не осталось пузырьков воздуха. При обнаружении в агаре разрывов делают заключение о наличии термофильных анаэробов (методическое указание, АГТУ,1998).
2.4 Выявление возбудителей брожения пектиновых веществ
Постановка опыта. Снопик льняной соломы высотой 6-7 см перевязывают в двух местах ниткой и вносят в пробирку лучше большего, чем стандартный, размера, наполненную на 2/3 водопроводной водой. Пробирку зажимают пинцетом и кипятят на горелке 2-3 мин для удаления экстрактивных (легкосбраживаемых) веществ, которые могут служить источником углерода для других маслянокислых бактерий. Вода приобретает желто-зеленый цвет. Ее сливают. Вновь наполняют пробирку водопроводной водой, кипятят несколько минут и сливают. Так поступают 5-6 раз. После последнего кипячения жидкость не сливают. Охлаждают пробирку под краном, и в снопик вводят свежую соломину, не подвергшуюся нагреванию.
Пробирку со снопиком ставят в термостат при 30-35°С. Через 2-3 дня в ней начинается брожение, а через 5-8 суток оно заканчивается. Накопление в культуральной жидкости масляной кислоты наряду с уксусной, образующейся при сбраживании продуктов гидролиза пектина, можно обнаружить при помощи качественных реакций на масляную кислоту.
Микроскопирование. Извлекают снопик изпробирки, из его середины вынимают несколько соломинок и выжимают из него немного жидкости на предметное стекло. Добавляют каплю раствора Люголя, накрывают покровным стеклом и микроскопируют с иммерсионной системой.
На препарате обычно видны крупные палочковидные бактерии с плектридиальным типом спорообразования (барабанная палочка) и прерывистым расположением гранулезы, окрашенной в синий цвет. Это Clostridium pectinovorum. Нередко обнаруживается Cl. felsineum - палочки меньшего размера сигарообразной формы со спорой на конце. Гранулеза может заполнять всю вегетативную часть клетки (Шильникова, 2004).
2.5 Выявление возбудителей брожения целлюлозы
Постановка опыта. Для получения накопительной культуры целлюлозоразрушающих бактерий используют среду Омелянского (приложение). В высокие пробирки на 2/3 заливают среду Омелянского, добавляют 1 г исследуемой почвы, затем пастеризуют 10 мин при 80° в целях освобождения от сопутствующих аэробных бесспоровых бактерий. На дно пробирки помещают полоски фильтровальной бумаги слоем 1,5-2 см, доливают стерильной питательной среды доверху и закрывают пробкой. Пробирки инкубируют при 30-35°С. Через 5-7 суток начинается брожение целлюлозы, в ходе которого интенсивно выделяются газы, фильтровальная бумага по мере сбраживания слегка ослизняется, желтеет и постепенно разрушается.
Микроскопирование. При исследовании целлюлозоразрушающих бактерий извлекают пинцетом со дна пробирки кусочек разлагающейся бумаги и размазывают по предметному стеклу без добавления воды. Мазок сушат обычным способом, фиксируют на пламени горелки и окрашивают фуксином. В пробирках развиваются длинные тонкие палочки с круглой спорой на конце - Clostridium omelianskii, также наблюдается развитие длинных крупных палочек с грушевидной спорой на конце - Clostridium dissolvens (Шильникова, 2004).
2.6 Выявление анаэробных азотфиксирующих микроорганизмов, вызывающих маслянокислое брожение
Постановка опыта. Для обнаружения в почве анаэробных азотфиксирующих бактерий рода, которые также вызывают маслянокислое брожение, Clostridium пользуются методом накопительной культуры в жидкой среде Виноградского (приложение). Среду наливают в пробирки высоким слоем, засевают комочками исследуемой почвы и пастеризуют 10 мин при 80° в целях освобождения от сопутствующих аэробных бесспоровых бактерий. Через 2-3 суток после посева среда мутнеет, из нее начинают выделятся пузырьки газа, что свидетельствует о развитии анаэробных споровых бактерий, вызывающих в соответствующих элективных условиях маслянокислое брожение. Глюкоза при этом превращается в масляную кислоту и углекислый газ, а в пробирках образуется много пены, появляется запах масляной и уксусной кислот. Последняя также является одним из продуктов маслянокислого брожения. Обычно этот метод используют для обнаружения клеток Clostridium pasteurianum, которые легко увидеть при микроскопировании осадка. Перед спорообразованием в клетках Clostridium pasteurianum накапливается много гранулезы, для которой характерно окрашивание раствором Люголя. Каплю жидкости, содержащую клетки клостридиев, накрывают покровным стеклом и к одному краю стекла подносят пипетку с раствором Люголя, а к другому - фильтровальную бумагу, которая засасывает раствор под покровное стекло. При микроскопировании препарата видны клетки клостридиев с потемневшим содержимым. Спора в клетке остается при этом неокрашенной и хорошо различима на темном фоне (Зенова, 2002).
3. Выделение бактерий рода Clostridium из разных объектов
3.1 Результаты посевов в жидкую среду Китт-Тароцци для выявления мезофильных и термофильных анаэробных микроорганизмов
Во всех пробирках (таблица 1, 2, 3) наблюдается помутнение среды, появление мути и гнилостного запаха, в некоторых пробирках - газообразование и образование пены на поверхности среды. Микроскопия показала наличие во всех пробирках спорообразующих грамположительных и грамотрицательных палочек. Тест на каталазу во всех пробирках отрицательный.
3.2 Результаты посевов для выявление возбудителей брожения пектиновых веществ
Во всех трех пробирках наблюдается помутнение среды, выделение газа, небольшое пенообразование. При микроскопировании обнаружены крупные палочковидные спорообразующие бактерии в виде барабанной палочки, окрашенные в синий цвет, с хорошо различимыми неокрашенными спорами, что свидетельствует о присутствии предположительно Clostridium pectinovorum и Clostridium felsineum.
3.3 Результаты посевов в жидкую среду Омелянского для выявление возбудителей брожения целлюлозы
При осмотре накопительных культур со средой Омелянского через несколько суток в пробирках с разными пробами почвы получены следующие результаты.
Проба почвы №1 (ясеневый лес): появление неприятного гнилостного запаха, небольшое газообразование, помутнение среды, выпадение осадка белого цвета, появление на бумаге желтых пигментных пятен. При микроскопировании обнаружены длинные тонкие палочки с круглой спорой на конце, что свидетельствует о присутствии предположительно Clostridium omelianskii.
Проба почвы №2 (поле): появление неприятного гнилостного запаха, обильное газообразование, помутнение среды, пожелтение и разрушение бумаги в некоторых местах. При микроскопировании обнаружены длинные тонкие палочки с круглой спорой на конце, что свидетельствует о присутствии предположительно Clostridium omelianskii.
3.4 Результаты посевов на жидкую среду Виноградского
При осмотре накопительных культур со средой Виноградского через несколько суток в пробирках с разными пробами почвы получены следующие результаты.
Проба почвы №1 (ясеневый лес): четко видимые изменения, такие как помутнение среды, выделение пузырьков газа, образование пены, появление запаха уксусной кислоты. При микроскопировании капли жидкости накопительной культуры, окрашенной раствором Люголя, видны клетки с потемневшим содержимым и неокрашенными спорами, хорошо различимой на темном фоне. Это свидетельствует о присутствии в среде предположительно Clostridium pasteurianum.
Проба почвы №2 (поле): видимых изменений практически нет, за исключением небольшого, едва заметного, помутнения. Однако, при микроскопировании капли жидкости накопительной культуры, окрашенной раствором Люголя, обнаружены клетки с потемневшим содержимым и неокрашенными спорами, хорошо различимой на темном фоне, в небольшом количестве. Это свидетельствует о присутствии в среде предположительно Clostridium pasteurianum.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
