Рис. 3. Схема расположения олигонуклеотидных последовательностей, задействованных в сайтспецифической рекомбинации в каппа локусе млекопитающих. Эти последовательности фланкируют с 3‘ стороны VL сегмент и с 5’ стороны JL сегмент. Во время рекомбинации гептамер и нонамер одного из VL сегмента объединяются с гептамером и нонамером одного из JL сегмента. Это делает возможным соединение VL и JLсегментов без нарушения рамки трансляции (Aguilera et al. , 1987; Hesse et al. , 1989). Обозначения: - сигнальные олигомеры.
Последовательность, в которой рекомбинируют локусы L-цепей, строго упорядочена во времени. Показано, что первыми перестраиваются локусы каппа типа, причем если в одной хромосоме перестройка оказалась нефункциональной, тоесть не привела к появлению полноценного гена, то рекомбинация происходит в каппа локусе на гомологичной хромосоме. В случае повторной абортивной перестройки аналогично происходят перестройки в лямбда локусах. Если в клетке непродуктивно перестроились все четыре локуса, то она превращатся в 0-клетку и подвергается апоптозу. Если же перестройка одного из локусов привела к образованию функционального гена, то рекомбинация остальных локусов блокируется. Детали механизма блокирования неизвестны, однако установлено, что необходимым условием для него является транскрипция продуктивно перестроенного гена. В результате в каждом индивидуальном лимфоците синтезируется только один тип L-цепей, каппа или лямбда, и экспрессия гена происходит только на одной из двух гомологичных хромосом. Эти феномены, называемые изотипическим и аллельным исключениями лежат в основе ключевого принципа функционирования иммунной системы - принципа клональной селекции (Пол, 1987; Strob, 1987).
В организме млекопитающих генерируется свыше десяти миллионов вариантов антител, хотя в геноме содержится значительно меньшее количество генных сегментов, которые могут участвовать в формировании вариабельных доменов. В случае L-цепей, основным источником разнообразия является комбинативное сочетание V и J сегментов. Дополнительным источником является смещение рекомбинационной рамки в месте их соединения. Кроме того, V генные сегменты могут обмениваться участками ДНК с псевдогенами посредством генной конверсии. Очень существенный вклад в разнообразие специфичностей антител вносит соматическое мутирование вариабельных генных сегментов в сайтах, участвующих в формировании антигенсвязывающего центра. Соматическое разнообразие генерируется при вторичном иммунном ответе путем включения гипермутационного механизма в клетках памяти в зародышевых центрах лимфатических узлов (Tonegawa 1983; Roitt et al. , 1993).
ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ Хрящевые рыбы.
Гуморальный иммунный ответ в виде специфических антител обнаруживается только у позвоночных. Наиболее примитивными видами, у которых обнаружена способность синтезировать ИГ, являются хрящевые рыбы. Представители трех основных таксонов (акулы, скаты и химеры) продуцируют антитела в ответ на введение широкого спектра антигенов. Однако, в отличие от млекопитающих, гетерогенность сывороточных антител у хрящевых рыб выражена очень слабо. Кроме того, у них не обнаружено созревание иммунного ответа - при вторичном введении антигена спектр антител не меняется (Flajnik, 1996). Результаты исследований последних лет продемонстрировали, что организация генов ИГ у хрящевых рыб также имеет ярко выраженные особенности.
У хрящевых рыб обнаружены гены трех типов L-цепей, локализующиеся в разных локусах. В каждом локусе геные сегменты организованы в кластеры, имеющие по одному V, J и C генному сегменту (рис. 4). Таких кластеров содержится несколько десятков или даже сотен в одном локусе на расстоянии 12-15 тпн друг от друга (Rast et al. , 1994).
Гены первого типа найдены у разнозубой акулы (Heterodontus francisci) (Shamblott and Litman, 1989) и малого ската (Raja erinacea) (Anderson et al. , 1995). У акулы кластеры имеют размер 3-6 тпн. V и J, J и C генные сегменты разделены примерно 0, 5 и 4 тпн соответственно. У ската V и J сегменты слиты в зародышевой ДНК.
Гены второго типа обнаружены у пятнистой химеры (Hydrolagus colliei) (Maisey, 1984), песчаной акулы (Carcharhinus plumbeus) (Hohman et al. , 1992; Hohman et al. , 1993), разнозубой акулы и малого ската (У всех изученных видов в кластерах этого типа V и J генные сегменты соединены уже в зародышевом геноме. V и C гeнные сегменты разделены 2-3 тпн. Рис. 4. Схема строения локусов генов L-цепей ИГ у акулы.
Организация генов у акулы имеет кластерный тип. Каждый кластер имеет размер 3 6 тпн и содержит по одному VL, JL и CL генному сегменту.
Обнаружено три типа генов L-цепей ИГ. Локусы генов первого и третьего типов имеют схожую организацию. В этом случае VL и JL, JL и CLсегменты разделены примерно 0, 5 и 4 тпн соответственно (А) (Rast et al. , 1994).
В локусе генов второго типа VL и JL сегменты соединены уже в зародышевом геноме (Б).
Третий тип генов L-цепей найден у акулы-няньки (Gynglimostoma cirratum) (Greenberg et al. , 1993) и разнозубой акулы (Rast et al. , 1994). В кластерах этого типа V и J, J и C генные сегменты разделены, как и в кластерах первого типа, примерно 0, 5 и 4 тпн соответственно. V и J генные сегменты фланкируются сайтами специфической рекомбинации со спейсерами 12 и 23 пн, что соответствует конфигурации спейсеров в локусах каппа типа млекопитающих. По первичной структуре гены третьего типа тоже наиболее близки к генам каппа типа высших позвоночных (гомология по аминокислотной последовательности составляет около 60%).
Гены этих трех типов имеют между собой низкую степень гомологии: 40-50% по нуклеотидной последовательности С сегментов и 50-60% по последовательности V сегментов (Hohman et al. , 1993).
Полученные данные показывают, что у хрящевых рыб имеется очень большое количество генных сегментов. Однако специфика организации генов исключает комбинативное сочетание сегментов. Все разнообразие антител у хрящевых рыб формируется только за счет экспрессии большого количества кластеров. Данные о нуклеотидных последовательностях из разных локусов выявили низкую гетерогенность генов (85-95%), что указывает на отсутствие соматического мутагенеза (Rast et al. , 1994). Костистые рыбы.
Анализ сывороточных антител пещерного сомика (Ictalurus punctatus) показал наличие трех типов L-цепей с различными молекулярными массами: 26, 24 и 22 кДа. Два вида антител мыши, 3F12 и 1G7, захватывают более 90% от общего количества иммуноглобулинов в реакции иммунопреципитации. При этом 3F12 антитела связываются с молекулами, содержащими L-цепи массой 24 и 22 кДа, а 1G3 антитела с другой субпопуляцией, содержащей L-цепи массой 26 кДа. На основе этих данных L-цепи разделяют на два класса, называемые F и G (Lobb et al. ,1984).
Геномная организация локуса L-цепей G типа имеет кластерный тип (рис. 5). В каждом кластере содержится по одному J и C сегменту и два V сегмена. Вариабельные генные сегменты расположены всегда в противоположной транскрипционной полярности к J и C сегментам . В ряде геномных клонов один V сегмент располагался с 3' стороны от C генного сегмента. Размер кластера равен примерно 3 тпн, расстояние между кластерами около 6 тпн (Ghaffari and Lobb, 1993; Bengten, 1994).
Хотя гены L-цепей сомика имеют низкую гомологию с генами других позвоночных (40-50% по нуклеотидной последовательности), их можно отнести к каппа типу высших позвоночных, так как сходство по первичной структуре с лямбда типом ниже. Кроме того, конфигурация спейсеров имеет характер каппа типа: 12 пн спейсер ассоциирован с V, 23 пн спейсер с J сегментом (Ghaffari and Lobb, 1993).
У радужной форели (Oncorhynchus mykiss), представителя другого семейства костистых рыб, также обнаружены два типа L цепей (Daggfeldt et al. , 1993). Один из них (L1) высокогомологичен G типу сомика по структуре V и C областей и соответствующий локус имеет сходную организацию.
По-видимому, у этих видов объединение V и J сегментов происходит только за счет инверсий с восстановлением единой полярности транскрипции. Разнообразие вариабельных доменов образуется в результате комбинативного сочетания V и J сегментов в пределах одного кластера. Не исключается, что в перестройки могут вовлекаться и соседние кластеры.
Интересной особенностью костистых рыб является очень высокая пропорция мРНК, представляющей так называемые стерильные транскрипты (Ghaffari and Lobb, 1993). Эти транскрипты включают в себя только С-сегменты и фланкирующие их 5’и 3’-нетранслируемые участки. Количество стерильных транскриптов у сомика и форели в 5 раз превышает количество полных VJC-транскриптов.
Рис. 5. Геномная организация локуса генов L-цепей ИГ у пещерного сомика. Генные сегменты организованы в кластеры. Каждый кластер содержит два VL и по одному JL и CL сегменту и имеет размер около 5 тпн. Расстояние между JL и CL около 1000 пн, VL сегменты удалены от 5' конца JL сегмента на 3 тпн. VLсегменты всегда расположены в противоположной транскрипционной полярности по отношению JL и CL сегментам (Ghaffari and Lobb, 1993). Амфибии.
У шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) выявлено три семейства генов L-цепей ИГ, кодирующих три различных изотипа: L1 (ро), L2 (сигма) и L3 (рис. 6).
Все три локуса имеют сегментарный характер организации. L1 локус содержит множественные VL1 сегменты, разделенные в геноме 2. 1 - 3. 6 тпн, пять JL1 сегментов, три из которых идентичны, и один CL1 генный сегмент (Stewart et al. , 1993). JL1 и VL1сегменты фланкируются каноническими гепта- и нонамерными сигнальными последовательностями, разделенными 12 пн у VL1 и 23 пн у JL1 сегментов (Sakano et al. , 1980). Локус генов второго типа разделяется на два семейства, s1 и s2, которые в геноме располагаются отдельно. Геном лягушки содержит множественные Vs1 и несколько Vs2 геных сегментов, одну пару Js1-Cs1 и пару Js2-Cs2(Schwager et al. , 1991). Расположение генов этого типа друг относительно друга точно не определено.
Недавно был обнаружен третий тип генов L-цепей у лягушки. В геноме лягушки содержится шесть семейств V сегментов этого типа. Общее количество VL3 элементов составляет по меньшей мере 30 копий. Каждый VL3 элемент может рекомбинировать с одной из двух пар JCL3 генных сегментов (Haire et al. , 1996). Гены трех типов значительно различаются: гомология на аминокислотном уровне составляет приблизительно 30% (Zezza et al. , 1991). В то же время, ряд признаков позволяет соотнести гены L1 и L3 типа с каппа и лямбда типами млекопитающих.
Семейство генов первого типа можно отнести к каппа типу по нескольким причинам (Zezza et al. , 1992): а) высокая гомология первичной структуры (более 50%); б) существенное сходство геномной организации локуса (много VL1 и один CL1генный сегмент); в) кофигурация спейсеров между гепта- и нонамерыми соответствует каппа типу; г) JL1 и CL1генные сегменты разделены примерно 3. 5 тпн, что приблизительно равно расстоянию между JLk и CLkэлементами человека (Sakano et al. , 1979; Hieter et al. , 1982) и значительно больше чем расстояние между JLl и CLl млекопитающих (Blomberg et al. , 1982; Udey, 1987).
Рис. 6. Геномная организация локуса первого и третьего типов генов L-цепей ИГ у шпорцевой лягушки.
Локус семейства L1 содержит множественные VL1 сегменты, пять JL1 сегментов один CL1 генный сегмент. Расстояние между VL1 равно 2. 1 - 3. 6 тпн. Локус семейства L3 имеет около 30 VL3 сегментов, располагающихся группами, JL3 и CL3 сегменты располагаются парами: JCL31 и JCL32 (Stewart et al. , 1993; Haire et al. , 1996).
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
