Для трансформации к 200 мкл суспензии компетентных клеток добавляли 30 нг плазмидной ДНК, растворенной в 100 мкл воды и выдерживали при 0оС в течение 30 мин. Затем инкубировали при 37оС в течение 5 мин, после чего добавляли 3 мл среды LB и инкубировали при 37оС еще 90 мин. Клетки собирали центрифугированием и высевали на селективную среду (Мазин и др. , 1988). Электротрансформация.
Для подготовки компетентных клеток E. coliштамм XL-1 Blue MRF ' выращивали в 100 мл среды LB (см. Химическая трансформация) при комнатной температуре до оптической плотности D550=0, 45. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4000 g, 4оС и промывали суспендированием последовательно в 100 мл, 50 мл и 10мл 10% раствора глицерина при 0-4оС. После этого клетки суспендировали в 240 мкл ледяного раствора GYT (10% глицерин, 0, 125% бакто-дрожжевой экстракт, 0, 25% бакто-триптон). Для трансформации к 40 мкл суспензии компетентных клеток добавляли 1 мкл ДНК вектора (50 нг) при 0-4оС и пропускали электрический разряд (U=18000 В). Затем добавляли 1 мл SOC (2% бакто-триптон, 0, 5% бакто-дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2, 5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза), перемешивали, переносили в 3 мл среды SOC, прогретой до 42оС, и инкубировали при 37оС в течение 1 часа (Wai Lin Tung and King-C. Chow, 1995). ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ КРОВИ РЫБ
Кровь собирали на холоду через каудальную артерию с добавлением на каждые 5 мл крови 1 мл 2, 7% раствора Na2ЭДТА, рН 7, 4. К выделенной крови добавляли равный объем трис-солевого буфера (TBS) (0, 14 М NaCl, 5 мМ KCl, 25 мМ трис-HCl, рН 7, 4). Смесь наносили при комнатной температуре на равный объем среды для выделения лейкоцитов, содержащей 24 части 9% фикола и 10 частей 34% верографина. После центрифугирования при 400 g в течение 30 мин отбирали слой лейкоцитов и разводили в большом объеме буфера TBS. После повторного центрифугирования при 300 g в течение 40 мин для лизиса остаточных эритроцитов клетки суспендировали в растворе, содержащем 9 объемов 0, 83% раствора NH4Cl и 1 объем 2, 06% раствора трис-HCl, рН 7, 62, до концентрации 108кл/мл и добавляли 5 объемов среды. После осаждения клеток при 300 g в течение 10 мин процедуру очистки повторили (Фримель, 1987). ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ
Осадок лейкоцитов после выделения и очистки суспендировали в 10 объемах (1 мл) раствора 1, содержащего 4 М гуанидин тиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, рН 7, 0, 0, 5% саркозил и 0, 1 М 2-меркаптоэтанол, при комнатной температуре. Затем добавляли 0, 1 мл 2 М раствора NaAc, рН 4, 0, 1 мл фенола, 0, 2 мл хлороформа и перемешивали. Затем центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин при 4оС, отбирали водную фазу, добавляли к ней равный объем изопропанола и осаждали РНК центрифугированием при 15000 g в течение 15 мин при 4оС (Chomczynski and Sacchi, 1987). ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
1 г печени стерляди, замороженной в жидком азоте, растирали в тонкий порошок и гомогенизировали в 15 мл раствора, содержащего 0, 5 М Na2ЭДТА, рН 8, 0, 0, 5% саркозила, 100 мкг/мл протеиназы К и нагретого до 65оС. Затем инкубировали при 50оС течение 3 часов при легком покачивании. Затем, избегая резких встряхиваний, экстрагировали ДНК равным объемом фенола три раза, каждый раз разделяя фракции центрифугированием при 4000 g и комнатной температуре. Фенол предварительно очищали перегонкой и насыщали буфером, содержащим 1 М трис-HCl, один раз и два раза буфером, содержащим 0, 1 М трис-HCl и 0, 1% 2-меркаптоэтанол. Диализ ДНК проводили при 10оС в течение 12 часов против 4 л буфера, имеющего состав: 50 мМ трис-HCl, рН 8, 0, 10 мМ Na2ЭДТА, 10 мМ NaCl.
Затем обрабатывали пробу РНКазой, свободной от ДНКазы, при 37оС в течение 1 часа в концентрации 100 мкг/мл. После этого экстрагировали ДНК равным объемом смеси фенол-хлороформ (1: 1) два раза и проводили диализ при 10оС в течение 36 часов против 10 л буфера TE (10 мМ трис-HCl, 1 мМ Na2ЭДТА, рН 7, 5), меняя буфер через каждые 12 часов (Маниатис и др. , 1984). КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК Выделение поли(A)+РНК.
Для ингибирования РНКазы все растворы, не содержащие трис, обрабатывали 0, 1% диэтилпирокарбонатом 12 часов при 37оС и автоклавировали. Посуду прокаливали при 250оС в течение 4 часов. Поли(A)+РНК выделяли из суммарной РНК лейкоцитов стерляди методом хроматографии на олиго(dT)-целлюлозе. Для этого РНК растворяли в воде, прогревали при 65оС в течение 5 мин, добавляли равный объем 2-кратного буфера для нанесения РНК (40 мМ трис-HCl, рН 7, 6, 1 М NaCl, 2 мМ Na2ЭДТА, 0, 2% SDS) и трижды пропускали через колонку с олиго(dT)-целлюлозой. Затем промывали колонку 5-10 объемами буфера для нанесения и 4 объемами этого же буфера, содержащего 0, 1 М NaCl. После этого элюировали поли(A)+РНК в 2-3 объемах воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, добавляли 2, 2 объема этанола и осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g при 4оС (Маниатис и др. , 1984). Синтез кДНК.
Синтез кДНК проводили в соответствии с протоколом фирмы Stratagene. По матрице поли(A)+РНК синтезировали первую цепь кДНК (рис. 9). Реакционная имела состав: 5 мкл 10-кратного буфера для синтеза первой цепи, 3 мкл смеси метил-dНTФ, 2 мкл раствора праймер-линкера (1. 4 мкг/мкл), 1 мкл ингибитора РНКазной активности, 1. 5 мкл фермента обратная транскриптаза (50 е. а. /мкл), вода до суммарного объема 50 мкл.
Смесь инкубировали при 37оС в течение 1 часа. Затем охлаждали до 0оС и добляли компоненты для синтеза второй цепи кДНК: 20 мкл буфера для синтеза второй цепи, 6 мкл смеси dНTФ, 88, 9 мкл стерильной воды, 2 мкл 32Р-dНTФ (800 Ки/мМ), 2 мкл раствора РНКазыH (1. 5 е. а. /мкл), 11. 1 мкл ДНК полимеразы I.
Смесь инкубировали при 16оС в течение 2, 5 часов, затем охлаждали до 0оС и добавляли компоненты для застройки “липких” концов: 23 мкл смеси дНTФ, 2 мкл Pfu ДНК полимеразы (2, 5 е. а. /мкл). Смесь инкубировали при 72оС в течение 30 мин.
Затем проводили экстракцию равным объемом смеси фенол-хлороформ (1: 1) и равным объемом хлороформа, после чего отбирали водную фазу, добавляли 20 мкл 3М NaAc и 400 мкл 96% этанола и осаждали кДНК центрифугированием при 12000 g в течение 12 мин. Сшивка молекул кДНК с вектором.
кДНК растворяли с EcoR I адапторами (рис. 9) и инкубировали при 4оС в течение 30 мин. Затем добавляли компоненты для сшивки молекул адапторов и молеул кДНК: праймер-линкер 5' CTCGAGTTTTTTTTTTTT 3' 3' AAAAAAAAAAAA 5' поли(A)+РНК Xho I сайт 1-я цепь EcoR I адаптор 5' р-TCGAGTTTTTTTTTTTT, ,, ,, ,, ,CTCGTGCCG-р 3' 3' р-CAAAAAAAAAAAA GAGCACGGCTTAA-р 5' 2-я цепь Xho I сайт кДНК EcoR I сайт 5' CTCGAGTTTTTTT, ,, ,, ,, ,, CTCGTGCCGAATTC 3’ 3' GAGCTCAAAAAAA GAGCACGGCTTAAG 5’ ДНК вектора ДНК вектора
Рис. 9. Схема синтеза кДНК по матрице поли(A)+РНК и сшивки с плазмидным вектором pBluescript KS(+) по сайтам EcoR I и Xho I.
Обозначения: ,, ,, , - метилированная цепь кДНК, -неметилированная цепь кДНК. 1 мкл 10-кратного буфера лигирования, 1 мкл 10 мМ рATФ, 1 мкл фермента ДНК лигазы фага Т4 (4 е. а. /мкл).
Смесь инкубировали при 4оС в течение 2-х суток, после чего инактивировали лигазу прогреванием при 70оС в течение 30 мин, охлаждали до комнатной температуры и добавляли компоненты для фосфорилирования концевых нуклеотидов: 1 мкл 10-кратного буфера лигирования, 2 мкл 10 мМ рATФ, 6 мкл стерильной воды,
1 мкл фермента полинуклеотидной киназы фага Т4 (10 е. а. /мкл). Реакционную смесь инкубировали при 37оС в течение 30 мин. Затем охлаждали до комнатной температуры и добавляли компоненты для образования липких концов по сайту рестрикции эндонуклеазы Xho I: 28 мкл буфера 4, 3 мкл Xho I (40 е. а. /мкл).
Смесь инкубировали при 37оС в течение 1, 5 часа. Затем добавляли 5 мкл 10-кратного буфера STE (1 М NaCl, 200 мМ трис-HCl, рН 7, 5, 100 мМ Na2ЭДТА) и пропускали через колонку с гелем сефакрил С-500. Фракции, содержащие молекулы с размером более 500 пн объединяли и экстрагировали ДНК равным объемом смеси фенол-хлороформ (1: 1) и равным объемом хлороформа. Затем добавляли двойной объем этанола, осаждали кДНК центрифугированием, промывали 80% этанолом и растворяли в 10 мкл воды. Для лигирования брали 5 мкл раствора кДНК (600 нг) и 2 мкл раствора вектора pBluescript KS(+) (1 мкг), имеющего "липкие" дефосфорилированные концы по сайтам рестрикции эндонуклеазами EcoR I и Xho I (рис. 9).
Затем добавляли 1 мкл 10-кратного буфера 3, 1 мкл 10 мМ раствора рATФ и 1 мкл фермента лигазы фага Т4 (4 е. а. /мкл). Смесь инкубировали при 4оС в течение 2-х суток, после чего экстрагировали равными обьемами фенол-хлороформа и хлороформа. Амплификация библиотеки.
Электротрансформацию проводили как описано в п. Трансформация прокариотических клеток, после чего высевали 1/1000 объема (2, 5 мкл) среды SOC на селективную среду с ампициллином (50 мкг/мл) для определения количества трансформированных клеток. Остальную часть помещали в 100 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и инкубировали при 37оС при перемешивании до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет величины D550=2-2, 5. Затем отбирали 1, 6х1011клеток, осаждали их центрифугированием, суспендировали в 4 мл среды LB и перемешивали с 4 мл глицерина. Полученную библиотеку хранили при -70оС. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Реакционная смесь полимеразной цепной реакции (ПЦР) содержала следующие компоненты: 100 нг ДНК матрицы, 100 нг невырожденного праймера, 500 нг вырожденного праймера, 5 мкл 2 мМ раствора дНTФ,
5 мкл 1-кратного буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8, 8, 50 мМ KCl, 1, 5 мМ MgCl2, 0, 001% желатин), 1 мкл Taq полимеразы,
вода до конечного объема 50 мкл (Dieffenbach and Dveksler, 1995). Температурный режим ПЦР.
Реакционную смесь инкубировали при 95оС в течение 5 мин, после чего добавляли Taq полимеразу и использовали температурный режим, при котором в течение первых 18 циклов температуру отжига праймеров понижали на 3оС черех каждые три цикла: 1й-18й циклы 95оС - 1 мин (денатурация ДНК), 50-35оС - 1 мин (отжиг праймеров), 72оС - 2 мин (полимеризация). 19-й-30-й циклы: 95оС - 1 мин, 50оС - 1 мин, 72оС - 2 мин. 31-й цикл: 95оС - 1 мин, 50оС - 1 мин, 72оС - 10 мин. СУБКЛОНИРОВАНИЕ ДНК
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
