У шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) выявлено три семейства генов L-цепей ИГ, кодирующих три различных изотипа: L1 (ро), L2 (сигма) и L3.
Все три локуса имеют сегментарный характер организации. L1 локус содержит множественные VL1 сегменты, разделенные в геноме 2. 1 - 3. 6 тпн, пять JL1 сегментов, три из которых идентичны, и один CL1 генный сегмент (Stewart et al. , 1993). JL1 и VL1сегменты фланкируются каноническими гепта- и нонамерными сигнальными последовательностями, разделенными 12 пн у VL1 и 23 пн у JL1 сегментов (Sakano et al. , 1980). Локус генов второго типа разделяется на два семейства, s1 и s2, которые в геноме располагаются отдельно. Геном лягушки содержит множественные Vs1 и несколько Vs2 геных сегментов, одну пару Js1-Cs1 и пару Js2-Cs2(Schwager et al. , 1991). Расположение генов этого типа друг относительно друга точно не определено.
Недавно был обнаружен третий тип генов L-цепей у лягушки. В геноме лягушки содержится шесть семейств V сегментов этого типа. Общее количество VL3 элементов составляет по меньшей мере 30 копий. Каждый VL3 элемент может рекомбинировать с одной из двух пар JCL3 генных сегментов (Haire et al. , 1996). Гены трех типов значительно различаются: гомология на аминокислотном уровне составляет приблизительно 30% (Zezza et al. , 1991). В то же время, ряд признаков позволяет соотнести гены L1 и L3 типа с каппа и лямбда типами млекопитающих.
Семейство генов первого типа можно отнести к каппа типу по нескольким причинам (Zezza et al. , 1992): а) высокая гомология первичной структуры (более 50%); б) существенное сходство геномной организации локуса (много VL1 и один CL1генный сегмент); в) кофигурация спейсеров между гепта- и нонамерыми соответствует каппа типу; г) JL1 и CL1генные сегменты разделены примерно 3. 5 тпн, что приблизительно равно расстоянию между JLk и CLkэлементами человека (Sakano et al. , 1979; Hieter et al. , 1982) и значительно больше чем расстояние между JLl и CLl млекопитающих (Blomberg et al. , 1982; Udey, 1987). Третий тип генов L-цепей лягушки более близок к лямбда типу млекопитающих: а) более высокая гомология с генами лямбда типа млекопитающих (около 50% сl- и 30-40% с k-типом по аминокислотной последовательности); б) JL3 и CL3 генные сементы экспрессируются всегда парами JL31-CL31 и JL32-CL32, что напоминает ситуацию в лямбда локусе человека и мыши (Haire et al. , 1996).
Гены второго типа L-цепей лягушки незначительное и приблизительно одинаковое сходство с генами каппа и лямбда типов млекопитающих (30-40% и 25-40% по нуклеотидной последовательности, соответствено) (Schwager et al. , 1991). Генетическое разнообразие у лягушки достаточно велико и сравнимо с разнообразием генов у млекопитающих. Однако репертуар антительных специфичностей в сыворотке крови значительно уступает репертуару высших позвоночных (Hsu et al. , 1991). Этот парадокс можно объяснить наличием механизма соматической селекции клонов В-лимфоцитов, который элиминирует клетки, несущие антитела, специфичные к собственным антигенам организма, а также те клетки, которые продуцируют несколько типов антител (Wilson et al. , 1992).
Основной вклад в формирование разнообразия L-цепей антител у лягушки дают первое и третье семейства генов, имеющие высокий комбинативный потенциал и большое разнообразие зародышевых V генных (Haire et al. , 1996). Второе семейство имеет несколько слабо отличающихся друг от друга VL2элементов и не играет существенной роли в формировании разнообразия (Stewart et al. , 1993). Таким образом, разнообразие генов L-цепей у лягушки а создается посредством: а) комбинативного соединения V и J генных сегментов; б) смещения рекомбинационной рамки при соединении V и J сегментов. Нельзя исключить, что определенный вклад в разнообразие может вносить соматический мутагенез. Во всяком случае, наличие этого механизма показано для генов H-цепей лягушки (Zezza et al. , 1992). ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ
Согласно наиболее популярной в настоящий момент гипотезе гены ИГ и Т-клеточных рецепторов произошли от одного предкового гена, кодировавшего один домен путем различных вариантов последовательных дупликаций. В эволюции генов ИГ можно выделить три основных события.
1. Разделение предкового V-подобного гена на V и J сегменты и возникновение механизма генерации разнообразия путем соматической рекомбинации. Предпологается, что это событие связано с внедрением транспозона в предковый ген и осуществилось до разделения ИГ и Т-клеточных рецепторов у предков хрящевых рыб (Gilbert, 1990). Наличие в геноме акул и скатов слитых VJ генов в локусах L-цепей классов I и II, является, по-видимому, вторичным событием и, возможно, обусловлено фиксацией генов, кодирующих антитела строго определенной специфичности (Anderson et al. , 1995).
2. Возникновение механизмов соматического мутагенеза генов ИГ. У млекопитающих соматический мутагенез обеспечивает как минимум половину разнообразия антител, являясь основой аффинного созревания антител при вторичном иммунном ответе (Пол, 1987). Достаточно выражен соматический мутагенез также у птиц (Thompson and Neiman, 1987; Reynaund et al. , 1987).
Ряд данных позволяет предполагать, что соматический мутагенез может осуществляться у хрящевых рыб и у амфибий, но эти результаты нуждаются в более тщательном изучении. В частности, у хрящевых рыб получение достоверных свидетельств затруднено наличием множественых кластеров генов, что не позволяет надежно соотносить данные по геномной структуре и структуре кДНК (Litman et al. , 1993).
3. Переход от кластерной к сегментарной организации генных сегментов. Сегментарная организация может иметь несколько преимуществ. Во-первых, увеличивается разнообразие продуцируемых антител за счет дополнительных возможностей комбинирования разных V и J сегментов. Во-вторых, уменьшается размер локуса за счет резкого сокращения количества C генов. В-третьих, подобная организация позволяет упростить регуляцию экспрессии различных локусов.
Ключевым принципом функционирования иммунной системы является принцип клональной селекции иммунокомпетентных клеток, несущих рецептор определенной специфичности. Ряд косвенных данных позволяет считать, что у акул гуморальный иммунный ответ клонально ограничен (Shankey and Clem, 1980). Однако неизвестно, каким образом и насколько эффективно осуществляется это ограничение (Flajnik, 1996). У млекопитающих принцип “одна клетка - одно антитело” обеспечивается благодаря изотипическому и аллельному исключению. При сегментарной организации генов продуктивная перестройка в одном из локусов ведет к блокированию перестройки других локусов и, тем самым к их инактивации. Однако, в случае наличия множественных VJC кластеров, в части из которых VJ сегменты слиты в зародышевой ДНК, механизмы контроля выборочной экспрессии могут быть более сложными или не столь эффективными. Таким образом, переход от кластерной к сегментарной форме организации генов ИГ мог иметь принципиальное значение для формирования полноценной системы гуморального иммунитета.
Вопрос о том, на каком этапе филогенеза произошел этот переход остается открытым. Уже у амфибий гены ИГ L- и Н-цепей организованы сегментарно. При этом, в случае L-цепей наблюдается два основных типа организации: каппа-подобный (один С ген, семейство J сегментов и семейство V сегментов) и лямбда подобный (несколько пар JC и семейство V сегментов). По всей видимости, различные типы L-цепей амфибий произошли от различных типов L-цепей хрящевых рыб, однако относительно невысокая гомология по первичной структуре не позволяет утверждать этого с определенностью (Gilbert, 1990). У сомика и радужной форели, представителей костистых рыб, организация генов L-цепей и Н-цепей отличается. Гены Н-цепей костистых рыб организованы подобно млекопитающим сегментарно (Bengten et al. , 1991). Организация генов L-цепей имеет кластерный характер. В то же время, в отличие от хрящевых рыб, транскрипционная ориентация V генов у них изменена.
Следует отметить, что сомовые и лососевые являются довольно специализированной группой, возникшей в эволюции относительно недавно. Особенности организации генов легких цепей у этих таксонов могут представлять собой новоприобретенные признаки (Romer, 1966).
В связи с этим особый интерес представляет изучение структры и организации генов L-цепей ИГ у костно-хрящевых рыб. Костно-хрящевые являются архаичной группой костистых рыб, возникшей значительно раньше настоящих костистых. Несмотря на то, что существуют различные мнения относительно последовательности появления костно-хрящевых и двоякодышащих (предков наземных позвоночных) (Ромер и Парсонс, 1992; Юдкин И. И. , 1941), очевидно, что костно-хрящевые в большей степени чем коститстые сохранили черты древних первично-костных рыб и, соответственно, с большим основанием могут рассматриваться как промежуточное звено между хрящевыми рыбами и амфибиями. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В агарозном геле.
Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в 1-кратном буфере ТАЕ, имеющем состав: 0. 04 М трис-ацетат, 2 мМ Na2ЭДТА (Маниатис и др. , 1984). В полиакриламидном геле.
Электрофорез ДНК проводили в 6% полиакриламидном геле в 0, 5-кратном буфере ТБЕ, имеющем состав: 0, 089 М трис-борат, 0, 089 М борная кислота, 2 мМ Na2ЭДТА. Для полимеризации геля к 50 мл раствора добавляли 300 мкл 10% раствора персульфата аммония и 30 мкл ТЕМЕД (Маниатис и др. , 1984). ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ГЕЛЯ Адсорбция на диэтиламиноэтилцеллюлозе.
Гель окрашивали в растворе бромистого этидия, участок геля с полосой ДНК вырезали, помещали в камеру и переносили ДНК на диэтиламиноэтилцеллюлозу в 0, 5-кратном буфере ТБЕ (см. Электрофорез ДНК (2)) при напряжении 40 В/см. Элюцию ДНК с диэтиламиноэтилцеллюлозы проводили путем инкубирования в течение 30 мин при 70оС в буфере, имеющем состав: 2 мМ NaCl, 1 мМ Na2ЭДТА, 40 мМ трис рН 8, 0 (Маниатис и др. , 1984). Адсорбция на кремниевой пудре.
Агарозный гель окрашивали в растворе бромистого зтидия, вырезали участок геля с ДНК и расплавляли инкубированием с двойным объемом 6 М раствора KI в течение 10 мин при 55оС. Затем добавляли суспензию кремниевой пудры (силики) в 3 М растворе KI в концентрации 100 мг/мл из расчета 300 мкг силики на 1 мкг ДНК и инкубировали в течение 2 мин при 55оС. После этого осаждали силику центрифугированием при 2000 g в течение 2 мин и дважды промывали суспендированием в растворе, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8, 0, 2, 5 мМ Na2ЭДТА и 50% этиловый спирт. Элюировали ДНК с силики суспендированием в воде (Boyle, Lew, 1995). Замораживание - оттаивание.
Агарозный гель с ДНК 10 мин инкубировали в жидком азоте и осаждали центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин, после чего добавляли к супернатанту 1/10 объема 3 М NaAc, 2 объема этанола и осаждали ДНК при 12000 g в течение 10 мин. ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ЗОНДОВ
500 нг ДНК-матрицы и 100 нг праймера денатурировали в 10 мкл воды при 100оС в течение 10 мин и быстро охлаждали до 0оС. Затем добавляли 10 мкл 10-кратного буфера (40 мМ KP04 рН 7, 5, 6, 6 мМ MgCl2 и 1, 0 мМ 2-меркаптоэтанол), 0, 1-0, 5 мКи 32Р-dATФ, 10 мкл 2 мМ раствора трех других немеченых дНTФ до концентрации 200 мкМ. Объем реакционной смеси доводили водой до 100 мкл, добавляли 3 мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (10-12 е. а. ) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Очистку зонда проводили методом гель - фильтрации на колонке с биогелем П-10 (Маниатис и др. , 1984). ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5
