Клонирование и анализ генов стерляди - (курсовая) - рефераты, скачать рефераты, бесплатно рефераты

Рефераты. Клонирование и анализ генов стерляди - (курсовая)

p>В результате проведенной работы идентифицирован локус генов, кодирующих L-цепи ИГ стерляди, представителя подкласса костно-хрящевых рыб. Сравнительный анализ структуры V генов этого локуса указывает, что он относится к каппа типу. Результаты сравнительного анализа С областей менее информативны, что само по себе не удивительно, так как С-гены L-цепей ИГ значительно менее консервативны чем V-гены. Тем не менее, тот факт, что на нуклеотидном уровне С-ген стерляди имеет наибольшее сходство с каппа-подобными генами III класса хрящевых рыб, также свидетельствует о том, что обнаруженный локус относится к каппа типу. кДНК клонов В1, С2, Е4, а также фрагмент, полученный с помощью ПЦР, содержат близкородственные V-гены. Различия между ними сконцентрированы в основном в области 3-го гипервариабельного района. Последовательности двух обнаруженных J-сегментов отличаются по 10 нуклеотидам, т. е. , они представляют собой различные геномные сегменты. Незначительные различия обнаружены также между тремя последовательностями С-генов. С-сегмент клона В1 отличается от полного С-сегмента клона С2 по 9 позициям, из которых 5 ведут к замене аминокислоты. По-видимому, эти последовательсти также представляют собой разные зародышевые гены.

Анализ структурной организации локуса с помощью Саузерн блот-гибридизации указывает, что у стерляди имеются множественные VLгены. Точная оценка их количества невозможна, но наличие более 20 полос гибридизации с разной интенсивностью сигнала, по аналогии с многочисленными литературными данными, позволяет говорить о нескольких десятках копий. При использовании С-зонда количество полос в мягких условиях гибридизации не превышает 4-х. Учитывая возможность аллелизма можно говорить о наличии в этом локусе 2-4х генов.

Ярко выраженное количественное превосходство V генов над С-генами является характерным признаком сегментарной формы организации локуса. У хрящевых и костистых рыб с кластерной организацией генов L-цепей количество V и С генов очень велико и приблизительно одинаково, что отражается в сходной картине блот-гибридизации. Полученные нами результаты являются серьезным основанием для того, чтобы утверждать, что у стерляди организация генов L-цепей каппа-подобного типа имеет сегментарный характер, подобный организации каппа локуса млекопитающих.

Эти данные указывают на то, что переход от кластерной к сегментарной организации произошел в филогенезе позвоночных очень рано, возможно уже у древних первично-костных.

ВЫВОДЫ

1. Сконструирована библиотека кДНК лейкоцитов стерляди представительностью 6х106независимых клонов. ПЦР ДНК библиотеки с помощью вырожденного праймера, соотвествующего J сегменту генов ИГ, позволил выявить фрагмент ДНК длиной 370 пн, гомологичный V генам ИГ позвоночных.

2. Из библиотеки кДНК с использованием продукта ПЦР в качестве зонда выделено пять клонов, содержащих вставки кДНК генов L-цепей ИГ. Сравнительный анализ первичной структуры кДНК клонов показал, что они являются членами одного семейства генов и имеют наибольшее сходство с генами каппа типа. 3. Согласно результам геномного блот-анализа идентифицированное семейство содержит несколько десятков V генов и только 2-4 С гена, что указывает на сегментарную форму его организации.

4. Полученные данные указывают что переход от кластерного типа организации генов ИГ, характерного для хрящевых рыб, к сегментарному, присутствующему у всех млекопитающих, произошел в эволюции в период появления первично-костных рыб.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Мазин А. В. , Кузнеделов К. Д. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск, 1988. 333 с.

Маниатис Т. , Фрич Э. , Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М. : Мир, 1984. 480 с.

Пол У. (ред. ) Иммунология. М. : Мир, 1987. Т. 1. 476 с.

Ромер А. С. и Парсонс Т. С. Анатомия позвоночных. М. : Мир, 1992. 358 с. Фримель Г. (ред. ) Иммунологические методы. М. : Медицина, 1987. 472 с. Юдкин И. И. Ихтиология. Москва-Ленинград: Пищепромиздат, 1941. Aguilera R. J. , Akira S. , Okazaki K. ,Sakano H. A pre-B cell nuclear protein wich specifically interacts with the immunoglobulin V-J recombination sequeces // Cell. 1987. V. 51. P. 909-917.

Anderson M. K. , Shamblott M. J. , Litman R. T. , Litman G. W. Generation of immunoglobulin light chain gene diversity inRaja erinaceais not associated with somatic rearrangement, an exception to a central paradigm of B cell immunity // Journal of Experimental Medecine. 1995. V. 182. P. 109-119.

Bengten E. The immunoglobulin genes in Atlantic cod (Gadus morhuna) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // Dissertations from the Faculty of Science and Technology. 1994. V. 19. Bengten E. , Leanderson T. , Pilstrom L. Immunoglobulin heavy chain cDNA from Atlantic cod (Gadus morhunaL. ): nucleotide sequences of secretory and membrane form show an unusual splicing pattern // European Journal of Immunology. 1991. V. 21. P. 3027-3033. Blomberg B. , Tonegawa S. DNA sequences of the joining regions of mouse llight chain immunoglobulin genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 530.

Boyle J. S. , Lew A. M. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purification // Trends in Genetics. 1995. V. 11. No. 1. p. 8. Chomczynski P. and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analytical biochemistry. 1987. V. 162. P. 156-159.

Daggfeldt A. , Bengten E. , Pilstrom L. A claster type organization of the loci of the immunoglobulin light chain in Atlantic cod (Gadus morhuna L. ) and rainbow trout (Oncorhynchus mykissWalbaum) indicated by nucleotide sequences of cDNAs and hybridization analysis // Immunogenetics. 1993. V. 38. P. 199-209.

Dieffenbach C. W. and Dveksler G. S. (edit). PCR primer. A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. 714 p. Durdik J. , Moore M. W. , Selsing E. Novel k light-chain gene rearrangements in mouse l light-chain-producing B limphocytes // Nature. 1984. V. 307. P. 749-752. Flajnik M. F. The immune system of ectothermic vertebrates // Veterinary Immunology and immunopathology. 1996. V. 54. P. 145-150.

Ghaffari S. H. and Lobb C. J. Structure and genomic organization of immunoglobulin light chain in the channel catfish // The Journal of Immunology. 1993. V. 151. P. 6900-6912.

Gilbert W. Evolution of antibodies: the road not taken // Nature. 1990. V. 320. P. 485.

Greenberg A. S. , Steiner L. ,Kasahara M. , Flajnik M. F. Isolation of a immunoglobulin light chain cDNA clone encoding a protein resembling mammalianklight chains: Implications for the evolution of light chains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 10603-10607.

Haire R. N. , Ota T. , Rast J. P. , Litman R. T. , Chan F. Y. , Zon L. I. , Litman G. W. A third Ig light chain gene isotype inXenopus laevis consists of six distinct VL families and is related to mammalian l genes // The Journal of Immunology. 1996. V. 157. P. 1544-1550. Hesse J. E. , Lieber M. R. , Mizuuchi K. , Gellert M. V(D)J recombination: the functional difinition of the joining signals // Genes Dev. 1989. V. 3. P. 1053-1061.

Hieter P. A. , Hollis G. F. , Korsmeyer S. J. , Waldmann T. A. , Leder P. Clastered arrangement of immunoglobulinl constant region genes in man // Nature. 1981. V. 294. P. 536. Hieter P. A. , Maizel J. V. , Leder J. , Leder P. Evolution of human immunoglobulink J region genes // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 1516. Hohman V. S. , Schluter S. F. , Marchalonis J. J. Complete sequence of a cDNA clone specifying sandbar shark immunoglobulin light chain: Gene organization and implications for the evolution of light chains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 276-280.

Hohman V. S. , Schuchman D. B. , Schluter S. F. , Marchalonis J. J. Genomic clone for sandbar sharkllight chain: Generation diversity in the absence of rearrangement // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 9882-9886.

Hsu E. , Lefkovits I. , Flajnik M. , Pasquier L. D. Light chain heterogeneity in the amphibian Xenopus // Molecular Immunology. 1991. V. 28. P. 985-994. immunoglobulin genes and the antibody repertoire // Molecular Biology Evolution. 1993. V. 10(1). P. 60-72.

Litman G. W. , Rast J. p. , Shamblott M. J. , Haire R. N. , Michele H. , Roess W. , Litman R. T, Hinds-Frey K. R. , Zilch A. , Amemiya C. T. Phylogenetic diversification of Lobb C. J. , Olson M. O. J. , Clem W. L. Immunoglobulin light chain classes in a teleost fish // The Journal of Immunology. 1984. V. 132. P. 1917-1923. Lundqvist M. , Bengten E. , Stromberg S. , Pilstrom L. Ig light chain gene in the siberiah sturgeon (Acipenser baeri) // The Journal of Immunology. 1996. V. 157. P. 2031-2038. Maisey J. G. Chondrichthyan phylogeny: a look at the evidence // J. Ven. Paleont. 1984. V. 4. P. 359-371.

Rast J. P. , Anderson M. k. , Ota T. Litman R. T. , Margittai M. , Shamblott M. J. , Litman G. W. Immunoglobulin light chain class multiplisity and alternative organizational form in early vertebrate philogeny // Immunogenetics. 1994. V. 40. P. 83-89.

Reynaund C. A. , Anquenz V. , Grimal H. , Weill J. C. A hyperconversion mechanism generates the chicken light chain preimmune repertoire // Cell. 1987. V. 48. P. 379-388.

Roitt I. , Brodstoff J. , Male D. Immunology. London: Mosby-Year Book Europe, 1993.

Romer A. S. Vertebrate Paleontology. Chicago: University Chicago Press, 1966. Sakano H. , Huppi K. , Heinrich G. , Tonegawa S. Sequences at the somatic recombination sites of immunoglobulin light-chain genes // Nature. 1979. V. 280. P. 288.

Sakano H. , Maki R. , Kurosawa Y. , Roeder W. , Tonegawa S. Two types of somatic recombination are necessary for the generation of complete immunoglobulin heavy-chain genes // Nature. 1980. V. 286. P. 676.

Sanger F. , Niklen, S. , Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1977. V. 74. P. 5463-5467 Schatz G. D. , Oettinger A. M. , Schlissel M. S. V(D)J recombination: molecular biology and regulation // Annual Review of Immunology. 1992. V. 10. P. 359-383.

Schwager J. , Burckert N. , Schwager M. , Wilson M. Evolution of immunoglobulin light chain genes: analysis of Xenopus IgL isotypes and their contribution to antibody diversity // The EMBO Journal. 1991. V. 10. P. 505-511. Seidman J. G. , Max E. E. , Leder P. A. A kimmunoglobulin gene is formed by site - specific recombination without further somatic mutation // Nature. 1979. V. 280. P. 370.

Shamblott M. J. and Litman G. W. Genomic organization and sequences of immunoglobulin light chain genes in a primitive vertebrate suggest coevolution of immunoglobulin gene organization // The EMBO Journal. 1989. V. 8. P. 3733-3739.

Shankey T. V. and Clem L. W. Phylogeny of immunoglobulin structure and function. IX. Intramolecular heterogeneity

of shark 19S IgM antibodies to the dinitrophenyl hapten //
J. Immunol. 1980. V. 125. P. 2690-2698.

Stavnezer J. , Kekish O. , Batter D. , Grenier J. , Balazs I. , Henderson E. , Zegers B. J. Aberrant recombination events in B cell lines derived fromk-deficient human // Nucl. Acids Res. 1985. V. 13. P. 3495-3514. Stewart S. E. , Pasquier L. D. , Steiner L. A. Diversity of expressed V and J regions of immunoglobulin light chains inXenopus laevis // European Journal of Immunology. 1993. V. 23. P. 1980-1986. Strob U. Transgenic mise with immunoglobulin genes // Annual Review of Immunology. 1987. V. 5. P. 151-174.

Thompson G. B. and Neiman P. E. Somatic diversification of the chicken immunoglobulin light chain gene is limited to the rearranged variable gene segment //Cell. 1987. V. 48. P. 369-378.

Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity // Nature. 1983. V. 302. P. 575-581.

Udey J. A. , Blomberg B. Human llight chain locus: organization and DNA sequences of three genomic J regions // Immunogenetics. 1987. V. 25. P. 63.

Wai Lin Tung, King-C. Chow. A modified medium for efficient electrotransformation of E. coli // Trends in Genetics. 1995. V. 11. No. 4. Р. 128-129.

Wilson M. , Hsu E. , Marcuz A. , Courent M. , Pasquier L. D. , Steinberg C. What limits affinity maturation of antibodies in Xenopus: the rate of somatic mutation or the abilityto select mutants? // The EMBO Journal. 1992. V. 11. P. 4337.

Zezza D. J. , Mikoryak C. A. , Schwager J. , Steiner L. A. Sequence of C region of L chains fromXenopus laevis Ig // The Journal of Immunology. 1991. V. 146. P. 4041-4047. Zezza D. J. , Stewart S. E. , Steiner L. A. Genes encoding Xenopus laevis Ig L chains. Implications for the evolution of k and l chains // The Journal of Immunology. 1992. V. 149. P. 3968-3977.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5