Было проведено исследование О. В. Сычуговой с соавторами (2003) с целью изучения возможности роста и развития видов микромицетов на композиции пленочного сополимера этилена и винилацетата с термопластичным крахмалом.

В процессе данного исследования было установлено, что они способны утилизировать данный источник углеродного питания. Однако динамика роста видов на разных средах при одинаковых условиях инкубации, при одной и той же навеске крахмала не одинакова, что особенно четко проявляется на 4 - 10-е сутки. Выявляется и некоторая разница в темпе роста видов грибов на нативном и растворимом крахмале разного происхождения, а также на средах Чапека и Гетченсона, взятых в качестве контроля (Сычугова, 2003).

Изменения морфологических признаков и образования новых структур у тест - культур на модифицированных средах при замене сахарозы на крахмал и росте на полимере не отмечаются, и они сопоставимы с параметрами, приведенными в определителях (Пидопличко, 1953; Ellis, 1971; Watanabe, 2000). Отличия выявлены у них только в темпах формирования морфологических структур. Хотя в литературе и приведены данные о влиянии субстрата на появление новых морфологических структур у грибов (Богомолова, 2001), однако, вероятнее всего, онтогенез и темпы развития определяются геномом вида, реализация программы которого зависит от влияния различных факторов (Шевцова, 1987; Долгова, 1997).

На поверхности пленки, содержащей термопластичный крахмал фиксируются сформированные пучки конидиеносцев Aspergillus niger, Paecilomyces variotii, Penicillium funiculosum, Chaetomium globosum, Trichoderma viride. Другие виды из взятого набора тест-культур не растут на данном субстрате или формируют слабое спороношение и в более поздние сроки.

Рост мицелия и формирование спороношения на композиции пленочного сополимера дает основание предполагать участие некоторых видов грибов в биодеструкции полимера из сополимеров этилена и винилацетата (СЭВА) с добавлением термопластичного крахмала (ТПК). Это дает возможность при последующих пересевах на смесях СЭВА и ТПК отобрать наиболее активные виды и их штаммы для разработки биотехнологии по его утилизации (Сычугова, 2003).

Таким образом, микроскопические грибы могут использовать в качестве источников углерода разнообразные органические вещества, тем самым являясь важными деструкторами различных природных материалов: целлюлозы, крахмала, лигнина, гемицеллюлозы, жиров, углеводородов, а также синтетических материалов, таких как пластики, пленки, упаковки пищевых продуктов. Поэтому предполагаемое исследование актуально и своевременно.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Объекты исследований

В качестве объектов исследования были выбраны коллекционные штаммы микромицетов рода Aspergillus: A. niger, A. ustus, A. terreus, A. flavus, A. fumigatus, а также штаммы родов Alternaria sp., Penicillium sp., Cladosporium sp., Trichoderma sp., Verticillium sp. Культуры были взяты из коллекции культур микроорганизмов кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ. Данные виды микромицетов были выделены из основных типов почв Астраханской области и из растительных субстратов: Aspergillus flavus и A. fumigatus из бурой полупустынной почвы Орловского смешанного леса, Alternaria sp. и Cladosporium sp. - из листьев клубники, Penicillium sp. - из каштановой почвы Дубового леса, Trichoderma sp., Verticillium sp. - из каштановой почвы Ясеневого леса.

В качестве источников углерода использовали модельные: сахара (лактоза, ксилоза, арабиноза, галактоза, мальтоза), многоатомные спирты (глицерин, сорбит), крахмал, целлюлоза; природные материалы (растительный опад, камыш, опилки, кора, сено).

2.2 Отбор и подготовка почвенного образца

Образцы почв для микробиологических исследований отбирают в стерильные пергаментные пакеты, полиэтиленовые пакеты или стеклянную посуду.

При отсутствии возможности анализировать образцы непосредственно после сбора, их в течение нескольких часов высушивают на воздухе, предохраняя от прямых солнечных лучей.

При подготовке почв к микробиологическому анализу необходимо провести следующие операции: очистить от камней, трав; разрушить почвенные агрегаты, используя метод растирания почвы в стерильной фарфоровой чашке пестиком (Градова, 2001).

2.3 Методы выделения плесневых грибов

При выявлении и учете микромицетов производят посев из разведения почвенной суспензии на плотные питательные среды. Наиболее часто используют подкисленные молочной кислотой, сусло - агар и синтетические среды с простыми углеводами (например, среда Чапека). Подкисление производят для того, чтобы убить бактерии.

При выявлении грибов, которые не развиваются на кислых средах, используют красители: бенгальский розовый, кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый. Применяют также комбинации из красителей и антибиотиков.

Грибы, которые не выдерживают конкуренцию за моносахара, выделяют на «голодные среды» - водный агар, агар с почвенной вытяжкой, агар с разведенным в 8-10 раз суслом. На этих средах микромицеты развиваются значительно медленней и образуют мелкие колонии. При выделении микромицетов, разлагающих целлюлозу, лигнин, гумусовые вещества, источник углерода добавляют к синтетической минеральной среде (Бабьева, 1989).

2.4 Методы идентификации плесневых грибов

Культуральные признаки грибов описывают на плотных питательных средах в чашках Петри. При описании культуральных признаков грибов отмечают внешний вид колоний, текстуру колоний (бархатистая, шерстистая, шероховатая, войлочная), окраску колоний, диффузию пигмента в агар, складчатость колонии, наличие экссудата.

Для характеристики морфологических признаков сначала рассматривают чашки при малом увеличении, а затем готовят микроскопический препарат - раздавленная капля (Бабьева, 1989).

Идентификация мицелиальных грибов основана главным образом на сопоставлении макроскопических и микроскопических признаков исследуемой культуры с ранее описанными признаками известных грибов. Для каждой идентифицируемой культуры необходимо определить цвет поверхности (у некоторых организмов и обратной стороны) и фактуру колоний, а также скорость роста по диаметру колоний (макроскопические признаки). Дальнейшая работа по идентификации связана с приготовлением препаратов репродуктивных органов: необходимо отмечать характер септирования гиф, тип конидиогенных клеток и вид их репродуктивных пропагул. Принадлежность грибов устанавливают по наличию разнообразных конидиальных спороношений как открытых, так и внутри специальных вместилищ - пикнид и отсутствии каких-либо половых спороношений. Применяемая на практике идентификация основана в основном на морфологических признаках конидиального спороношения, которые чрезвычайно разнообразны. Принадлежность к классу и роду устанавливают по определителям (Егоров, 1986; Билай, 1987; Саттон, 2001; Еремеева, 2007; Booth, 1971; Pitt, 1991; Klich, 1992).

2.5 Принципы составления питательных сред для грибов. Основные принципы композиции сред

При составлении питательных сред для грибов обычно пользуются результатами предварительных исследований по выяснению значения для роста и развития изучаемого объекта концентрации отдельных компонентов (источников углерода, азота, зольных веществ и витаминов).

Основными правилами, которых придерживаются при составлении сред, способствующих росту грибов, являются следующие:

1) целесообразно применять отдельные источники углерода и азота;

2) концентрация вещества, служащего источником азотного питания, должна сильно уступать концентрации вещества - источника углерода (примерно в 10 - 15 раз).

Хотя среды натурального происхождения более благоприятны для роста большинства грибов, однако при физиологических экспериментах по изучению развития и обмена у грибов использовать их нежелательно, так как их состав непостоянен. Для этих экспериментов обычно используются синтетические среды. Одной из первых синтетических сред для грибов (культур видов аспергиллов и пенициллов) была среда Роллена следующего состава (г/л):

сахароза - 72 (около 5 %);

винная кислота - 4,0 (для подкисления среды);

фосфорнокислый аммоний - 4,0;

углекислый калий - 0,6;

сернокислый аммоний - 0,25;

сернокислый цинк - 0,07;

сернокислое железо - 0,07;

кремнекислый калий - 0,07;

дистиллированная вода - 1,5 л.

Более простой состав имеет среда Чапека (г/л):

сахароза - 30,0;

NaNO3 - 2,0;

MgSO4 - 0,5;

FeSO4 - 0,01;

KH2PO4 - 1,0;

KCl - 0,5;

дистиллированная вода - 1,0 л.

Для многих грибов указанные здесь среды являются неполноценными. Некоторые грибы (особенно витаминозависимые) растут на них плохо или совсем не растут. В таких случаях, если потребность данного организма в витаминах не изучена, необходимо добавлять в среду экстракты растительных или животных тканей, выбирая их исходя из экологии данного гриба. Например, в среды для выращивания грибов - дереворазрушителей добавляют опилки из древесины той породы дерева, которую они поражают в природе, для выращивания грибов - паразитов растений - ткани растения - хозяина; выращивание грибов - копрофилов производится на средах с навозным экстрактом (Беккер, 1983).

2.6 Приготовление питательных сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла. Перед употреблением посуду тщательно мыли, полоскали и высушивали. Среды варили в стеклянных колбах объемом 250 мл. Каждой среды готовили объемом по 150 мл, рассчитанной на 10 культур исследуемых штаммов. После варки среды стерилизовали в автоклаве при 0,5 атм и 120 _С в течение 20 минут. После стерилизации и добавления соответствующих источников углеродного питания среды разливали в стерильные чашки Петри по 20 мл. Предварительно в чашки вносят по 1 капле молочной кислоты для подкисления среды, которое необходимо, чтобы убить бактерии.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7