2.7.1 Определение радиальной скорости роста на твердой среде

Микромицеты характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма. Чтобы выяснить возможность роста гриба за счет тех или иных углеродсодержащих веществ, их высевают на синтетические среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды.

В качестве единственного источника углерода использовали сахара (лактоза, ксилоза, арабиноза, галактоза, мальтоза), многоатомные спирты (глицерин, сорбит), крахмал, целлюлоза, природные целлюлозные материалы (растительный опад, камыш, опилки, кора, сено). Источники углерода добавляли в среду в мелко нарезанном виде. Все источники углерода добавлялись в среды количеством 45 г/л.

В данной работе определение особенностей роста грибов на различных источниках углеродного питания проводилось путем поверхностного посева исследуемых штаммов на среду Чапека без сахарозы с различными источниками углерода. Посев культур осуществляли уколом в центр чашки Петри. Время культивирования составляло 14 суток, температура культивирования - 24 _С. Параллельно производят посев на среду Чапека с сахарозой (контроль 1) и без сахарозы (контроль 2). Значение применяемых питательных сред для процессов роста грибов оценивалось методом измерения радиальной скорости роста путем периодического замера диаметра колоний грибов (через каждые 48 часов), растущих на чашках Петри.

Определение радиальной скорости роста грибов проводили на плотной питательной среде за определенный промежуток времени. После 48 часов инкубации при 24 _С измеряли диаметр выросших на чашках колоний при помощи линейки. Эту операцию повторяют через каждые двое суток в течение двух недель.

За диаметр отдельной колонии в данный момент времени принимают среднее арифметическое измерение. Вычисление радиальной скорости проводят по формуле:

Kr = (r - ro) / (t - to),

где k - радиальная скорость роста;

ro - радиус колоний в начальной момент времени to;

r - радиус колоний в момент времени t (Паников, 1991).

2.7.2 Изучение прорастания спор в капле субстрата

На основании метода проращивания грибных зачатков во влажной камере, можно определять способность грибов к ассимиляции различных субстратов. На предметные стекла с лункой наносятся споровая суспензия в гидролизате (камыша, опилок, сена, растительного опада, коры), сверху накрывали покровными стеклами, и помещали во влажную камеру. Предварительно гидролизаты готовили: мелко измельченные растительные материалы заливали дистиллированной водой количеством 10 г на 1 л, кипятили в течение 15 минут для наибольшего выхода воднорастворимых органических веществ из растительных субстратов, затем подвергали стерилизации при 120 _С в автоклаве. Споровую суспензию готовили следующим образом: микроскопические грибы 10 дней выращивали на среде Чапека в пробирках (скошенный агар), после производили смыв 10 мл гидролизата. Для удаления обрывков мицелия суспензию фильтровали через 2-слойную стерильную марлю. Чистоту и плотность суспензии проверяют при микроскопировании в камере Горяева. Для основных опытов плотность споровой суспензии составляет 106 спор в мл. Прорастание спор начинают учитывать через 24 часа. Прорастание спор рассчитывается как отношение числа проросших спор к общему числу просмотренных. Наблюдение проводят на 1, 2, 3, 7, 15-е сутки. Стекла микроскопировали, учитывая прорастание спор (%), длину проростков (в мкм) (Кураков, 2001).

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ РОСТА МИКРОМИЦЕТОВ НА РАЗЛИЧНЫХ СУБСТРАТАХ

Объектами исследования явились 10 штаммов коллекционных микроскоскопических грибов родов Aspergillus: A. niger, A. ustus, A. terreus, A. flavus, A. fumigatus, а также штаммы родов Alternaria sp., Penicillium sp., Cladosporium sp., Trichoderma sp., Verticillium sp. В качестве источников углерода использовали сахара (лактоза, ксилоза, арабиноза, галактоза, мальтоза), многоатомные спирты (глицерин, сорбит), крахмал, целлюлоза, природные целлюлозные материалы (листья, камыш, опилки, кора, сено).

В результате посева исследуемых микроскопических грибов на среду Чапека с различными источниками углерода было установлено, что изменение трофических условий оказывает существенное влияние на развитие микромицетов. Оценка возможности потребления различных источников углерода показала, что они способны утилизировать многие источники углеродного питания, но большинство из исследуемых видов не использовали опилки в качестве единственного источника углерода. Динамика роста видов на разных средах при одинаковых условиях инкубации, не одинакова.

3.1 Радиальная скорость грибов на модельных субстратах

В таблице приложения и на рисунках 1-2 приведены зависимости радиальной скорости роста от времени у изученных грибов на модельных источниках углерода.

Рис. 1. Радиальная скорость роста микромицетов рода Aspergillus на сахарах

Уже на первые сутки культивирования A. niger хорошо развивается во всех средах, кроме среды с ксилозой. На среде с мальтозой с 144 ч экспозиции наблюдается стадия логарифмического роста, после 216 ч - фаза отмирания культуры. К концу времени инкубации скорость роста колоний уменьшается и становится почти одинаковой на всех средах.

В первые дни культивирования наибольшая скорость роста A. terreus наблюдается на средах с арабинозой и галактозой. В промежутке 96 - 144 ч экспозиции на среде с арабинозой длится логарифмическая фаза роста, затем скорость радиального роста колонии идет к убыванию. На 14-е сутки культивирования наблюдается резкий скачок в росте на среде с галактозой.

Наибольший рост A. fumigatus наблюдается на среде с мальтозой. До 96 ч культивирования радиальная скорость роста на всех средах была примерно одинаковой. Затем на среде с мальтозой наблюдается фаза логарифмического роста (144 - 216 ч), затем радиальная скорость роста уменьшается. После 264 ч экспозиции происходит резкий скачок радиальной скорости на среде с арабинозой. На остальных источниках углерода культура растет со средней скоростью роста.

A. flavus хорошо растет на среде с галактозой в течение всего времени экспозиции. На среде с лактозой до 72 ч наблюдается логарифмическая фаза интенсивного роста, затем происходит уменьшение радиальной скорости роста.

Скорости радиального роста A. ustus на всех источниках углеродного питания сильно не различаются. Небольшой скачок в росте наблюдается на среде с галактозой в промежутке 144 - 216 ч.

Таким образом, сахара легко усваиваются всеми исследуемыми штаммами. В среднем скорость радиального роста не превышает 0,4 мм/ч у всех исследуемых штаммов.

Рис. 2. Радиальная скорость роста микромицетов рода Aspergillus на других углеродсодержащих субстратах.

Наибольшая скорость роста A. niger наблюдается вначале культивирования на средах с целлюлозой и глицерином. На этих средах логарифмическая фаза роста приходится на 48 - 140 ч экспозиции, стационарная фаза отсутствует. Затем скорость роста на целлюлозе резко падает и становится минимальной на этой среде. На других источниках углерода также наблюдаются скачки роста, которые к концу инкубации заметно уменьшаются. На среде с крахмалом наблюдается логарифмическая фаза (48 - 96 ч), затем наступает стационарная фаза роста, после 144 ч радиальная скорость роста колонии уменьшается. На средах с целлюлозой, глицерином и сорбитом вид растет с 2-суточной периодичностью.

Рост A. terreus наблюдается на всех легкоусвояемых источниках углерода, кроме среды с сорбитом. Вначале и в конце культивирования радиальная скорость роста примерно одинаковая. На среде с целлюлозой наблюдается очень низкая скорость радиального роста. На глицерине с 144 ч по 216 ч времени культивирования длится фаза логарифмического роста, затем радиальная скорость роста колонии идет к падению.

По данным рисунка 2 видно, что рост A. fumigatus имеет большие скачкообразные изменения, особенно проявляющиеся на среде с глицерином. Наибольшая скорость роста проявляется на среде с глицерином. Рост на среде с сорбитом до 96 ч времени культивирования не наблюдается. В промежутке 96 - 144 ч на этой среде происходит фаза усиленного логарифмического роста, затем скорость роста уменьшается. На сорбите и целлюлозе культура развивается с 2-суточной периодичностью.

Радиальная скорость роста A. flavus вначале и в конце культивирования примерно одинаковая. В середине инкубации наблюдаются скачки роста, особенно на среде с крахмалом. Высокая скорость роста наблюдается на 144-264 ч. инкубации. На среде с сорбитом, целлюлозой и глицерине с 96 ч экспозиции наблюдается логарифмическая фаза роста, затем на глицерине наступает стационарная фаза (144 - 200 ч), после происходит уменьшение скорости радиального роста.

Наибольшая скорость роста A. ustus наблюдается на среде с глицерином. Скорость роста на среде с сорбитом и целлюлозой наименьшая и в течение всего времени культивирования значительно не изменяется.

В целом, рост микромицетов на многоатомных спиртах, целлюлозе и крахмале характеризуется высокими биологическими ритмами, приходящимися на середину времени культивирования - 144-264 ч.

Таким образом, при определении способности штаммов использовать различные модельные источники углерода, было выяснено, что на сахарах наибольшая скорость роста A. niger наблюдается на среде с мальтозой, A. terreus, A. fumigatus и A. ustus проявляют наибольшую скорость роста на средах с галактозой, а A. flavus - на среде с ксилозой. На крахмале, целлюлозе и многоатомных спиртах все исследуемые штаммы проявляли высокую скорость роста, за исключением A. terreus, рост которого на среде с сорбитом вообще не наблюдался.

В среднем скорость радиального роста на других модельных субстратах составляет 0,2 мм/ч. В целом все культуры растут по классической схеме: лаг-фаза (очень маленькая 2-3 ч) - экспоненциальная фаза - стационарная фаза (не на всех средах) - стадия отмирания.

3.2 Радиальная скорость роста грибов на естественных субстратах

На рисунке 3 приведены зависимости радиальной скорости роста от времени у исследуемых грибов на различных природных целлюлозных материалах.

Рис. 3. Радиальная скорость роста микромицетов на природных субстратах

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7