В результате эндоцитоза и быстрого рециклирования плазматической мембраны происходит поглощение не только жидкостей. Одна из основных функций этого процесса состоит в облегчении поглощения внеклеточных белков. Большинство рецепторов, перечисленных в табл. 9.2, которые концентрируются в окаймленных ямках, связываются с такими макромолекулярными лигандами, как гликопротеины, липопротеины низкой плотности или иммуноглобулины. Кроме того, имеются рецепторы для факторов роста и таких гормонов, как ФРЭ или инсулин, когда в результате рециклирования плазматическая мембрана быстро освобождается от комплексов гормон-рецептор, заменяемых ново синтезированными рецепторами. Структурные детерминанты, которые опосредуют связывание этих рецепторов с окаймленными ямками, неизвестны. Установлена первичная структура нескольких таких рецепторов, при этом никакого сходства между ними не выявлено. Все они имеют единственный трансмембранный сегмент, но у одних N_конец обращен в цитоплазму, а у других ориентирован в противоположном направлении. В нескольких случаях было показано, что цитоплазматический домен рецептора необходим для того, чтобы рецептор оставался в незамкнутых ямках, но об этом известно очень мало.
Судьбы рецептора и лнганда после их поглощения клеткой различаются. Исходя из этого можно выделить четыре основные группы систем лиганд-рецептор.
Группа I. Рецептор возвращается к поверхности клетки, лиганд направляется в лизосомы. Примерами служат ЛНП- и асиалоглико-протеиновый рецепторы.
Группа II. Как рецептор, так и лиганд направляются в лизосомы. Примерами являются ФРЭ- и инсулиновый рецепторы.
Группа III. Рецептор остается связанным с лигандом, а лиганд направляется в другой домен плазматической мембраны. Это явление называется трансцитозом и характерно для рецепторов иммуноглобулинов в поляризованных эпителиальных клетках. После такого клеточного «транзита» рецепторы для IgA и IgM подвергаются протеолитическому расщеплению, тогда как рецептор для IgG при некоторых условиях может использоваться вновь.
Группа IV. И рецептор, и лиганд возвращаются к одному и тому же домену плазматической мембраны. Наиболее полно охарактеризованным примером такого рода служит трансферриновая система, в которой после поглощения комплекса трансферрин-железо и удаления железа комплекс апотрансферрин-рецептор возвращается к клеточной поверхности.
Скорости всех этих процессов достаточно велики. Обычно время жизни рецепторов, возвращающихся к клеточной поверхности, составляет всего 3 - 6 мнн, а время полного оборота рецептора - около 15 - 25 мин. В равновесном состоянии на клеточной поверхности обнаруживается около 65 - 75% рецепторов, а остальная их часть находится на разных внутриклеточных мембранах. Полный анализ равновесной кинетики поглощения и процессинга может быть проделан с привлечением констант скоростей для каждого элементарного шага,
Одной из характерных особенностей механизма сортировки является его удивительная точность. Например, трансферриновый рецептор почти всегда находится в базолатеральной, но не в апикальной мембране поляризованных эпителиальных клеток. Вероятность его ошибочного включения в апикальную мембрану составляет лишь -0,1%, т. е. достаточно мала для сохранения полярности мембран этих клеток. В других системах, где по экспериментальным данным вероятность ошибки достигала 4%, для корректировки локализации рецепторов был необходим дополнительный этап сортировки.
Механизм сортировки должен быть весьма изощренным. По-видимому, различные комплексы рецептор-лиганд поглощаются вместе в одних и тех же частях окаймленных везикул, а сортировка внутри везикул происходит за несколько минут. Например, рецептор для асналогликопротеинов перемещается в латеральном направлении внутри эндосомной системы и концентрируется в трубочках и маленьких везикулярных компонентах, но не в крупных везикулах. Возможно, крупные эндосомные везикулы, практически лишенные этого рецептора, но содержащие гликопротеино-вый лиганд, сливаются затем с лизосомами. Однако трубочки, содержащие рецептор, возвращают его к клеточной поверхности. В этом случае сортировка несомненно происходит внутри эндосомного комплекса органелл.
Какой механизм лежит в основе быстрой сортировки макромолекул? Конечно, должны существовать особые структурные «сигналы», приводящие к компартмеитализации специфических рецепторов и лигандов. Единственным известным сигналом является ман-нозо_6_фосфат, который присутствует на ферментах, направляющихся в лизосомы. Маннозо_6_фосфатспецифичные рецепторы находятся в комплексе Гольджи, где они направляют новосинтезированные белки в лизосому, а также на плазматической мембране, где они вызывают секрецию таких ферментов во внешнюю среду.
Помимо специфических структурных сигналов сортировки большую роль играет закисление внутриклеточных везикулярных компартментов. Значение рН в эндоцитозных пузырьках составляет 5,0 - 6.2. При столь низких рН происходит диссоциация комплексов рецептор-лиганд, включающих липопротеины низкой плотности, лизосомные ферменты, асиалогликопротеины, фактор роста эпидермиса и инсулин. В таких условиях от комплекса трансферрин-рецептор отсоединяются и два атома железа, хотя в этом случае апотрансферрин остается связанным со своим рецептором.
У некоторых оппортунистических вирусов и токсинов выработались механизмы проникновения в клетку, основанные на закислении везикул. Например, дифтерийный токсин связывается с каким-то неидентифицированным рецептором на клеточной поверхности и затем поглощается эндоцитозным путем. Понижение рН эндоцитозных везикул индуцирует в молекулах токсина конформационное изменение, что приводит к его проникновению через везикулярную мембрану и позволяет ферментативно активной части токсина достичь цитоплазмы. рН-индуцируемое конформационное изменение может вызвать образование трансмембранной поры. Многие вирусы животных, имеющие оболочку, тоже попадают в цитоплазму путем эндоцитоза. Низкое значение рН, отмечаемое в эндоцитозных везикулах, индуцирует конформационное изменение в гликопротеинах, входящих в состав шиловидных структур вирусных мембран, что облегчает как слияние мембраны вируса с мембраной эндоцитозной везикулы, так и доставку вирусного генома в цитоплазму. Примерами могут служить вирус леса Семлики и вирус гриппа.
рН во внутриклеточных компартментах может повышаться при добавлении слабых оснований или ионофоров. Слабые основания могут проходить через липидный бислой в незаряженной форме и протонироваться в кислом содержимом компартмента. В результате рН в компартменте может повышаться на 1-2 единицы и блокировать многие рН-зависимые процессы. Такие слабые основания часто называют «лизосомотропны-ми» или «ацидотропными» агентами. Моненсин уравновешивает протонный и К+-градиенты, что также увеличивает рН в вакуолях.
Добавление этих агентов часто предотвращает рециклирование рецепторов клеточной поверхности. Комплексы рецептор-лиганд при этом не диссоциируют, и рецепторы накапливаются во внутренних мембранных везикулах, не достигая клеточной поверхности. Такая картина наблюдается, например, для ЛНП- и асиалоглико-протеинового рецепторов. По-видимому, обмен между периферическими эндосомами и плазматической мембраной при этом не ослабевает, однако миграция к лизосомам может блокироваться.
Большие успехи в изучении этой сложной системы сортировки были достигнуты благодаря применению электронной микроскопии при искусном использовании таких клеток, как пероксидаза хрена, а также рН-контролирующих меток. Весьма полезными оказались и генетические подходы, основанные на резистентности к определенным токсинам и вирусам при неполном закислении эндоцитозных везикул. Источником соответствующих мутантов могут быть дрожжи. Биохимические исследования основываются на выделении и характеристике хорошо известных субпопуляций эндоцитозных везикул. Для разделения эндоцитозных и экзоцитозных везикул используются специально разработанные электрофоретические методы, подходы, основанные на иммунологическом сродстве, а также процедуры со смещением плотности при использовании холинэстеразы. В некоторых лабораториях удалось провести слияние изолированных эндоцитозных пузырьков in vitro и показать, что для этого необходим АТР; слияние происходило только в случае эндоцитозных пузырьков, полученных в течение 5 - 15 мин после интерналнзации.
3.3 Клатрин
При эндоцитозе наблюдаются в первую очередь такие структуры, как окаймленные ямки и окаймленные везикулы. Их характерной особенностью является наличие на цитоплазматической поверхности полигональной решетки, образуемой клатрином. Свойства клатрина и ассоциированных с ним белков определяют, какие именно рецепторы скапливаются в окаймленных ямках; эти свойства каким-то образом опосредуют и изменение мембраны, приводящее к отшнуровыванию окаймленных везикул. Молекула клатрина содержит три тяжелые цепи и три легкие и имеет сложную структуру с тремя ветвями; каждая из ветвей образована одной тяжелой цепью и одной легкой. Выделенный клатрин спонтанно ассоциирует с образованием полигональной решетки как в присутствии, так и в отсутствие мембран. Работы по реконструкции с очищенными плазматическими мембранами показали, что в местах образования окаймленных ямок имеется ограниченное число участков связывания с высоким сродством к клатрину. С клатриновой решеткой связаны и вспомогательные белки с мол. массами 100 и 50 кДа.
Каждая клетка продуцирует два основных класса легких цепей клатрина. Они кодируются двумя разными генами, мРНК которых подвергается дифференциальному сплайсингу, что приводит к появлению по меньшей мере четырех разновидностей белков. Тяжелые цепи играют структурную роль, а легкие, вероятно, выполняют регуляторную функцию и содержат места связывания кальмодулина, а также АТР-зависимого раздевающего белка. В клетке половина клатрина находится в растворе, и между этой формой и мембранными структурами поддерживается динамическое равновесие. До слияния окаймленных везикул с эндоцитозной системой из них должен высвободиться клатрин; эта реакция катализируется раздевающим белком, который выполняет чисто каталитическую функцию, однако остается прочно связанным с молекулами клатрина даже в отсутствие клатриновой решетки. В клетке этот белок находится в избытке по отношению к клатрину.
Чтобы понять природу рецепторзависимого эндоцитоза и его регуляции, необходимо выяснить механизм перехода клатрина из мономерной формы в мембраносвязанную структуру и обратно, а также механизм образования таких структур на мембране.
3.4 Некоторые примеры интернализуемых рецепторов
Рассмотрим вкратце свойства некоторых рецепторов. Все они имеют единственный трансмембранный домен, но этим сходство и ограничивается. Мы остановимся на рецепторах групп I, III и IV.
ЛНП-рецептор человека
Это типичный рецептор группы I, который возвращается к плазматической мембране, в то время как его лиганд, сывороточный липопротеин низкой плотности, попадает в лизосому. Особенно богаты этим рецептором клетки печени и надпочечников, куда ЛНП поставляют холестерол для синтеза желчных кислот и стероидных гормонов соответственно. По данным об аминокислотной последовательности рецептора, определенной с помощью кДНК, он состоит из пяти доменов. Выраженная гомология с другими мембранными рецепторами отсутствует, хотя два самых крупных наружных домена содержат повторы, богатые цистеином и гомологичные соответственно фактору С9 комплемента и предшественнику ФРЭ. Рецептор имеет единственный трансмембранный домен и непротяженный цитоплазматический С-концевой домен. Показано, что у лиц с таким генетическим заболеванием, как семейная гиперхолестеролемия, ЛНП-рецепторы не функционируют. Установить функции структурных доменов рецепторов помог мутационный анализ. Так, было показано, что модификации в цитоплазматическом домене ЛНП-рецептора препятствуют связыванию рецептора с окаймленными ямками, даже если связывание ЛНП с рецептором не изменяется. Помимо выявления мутаций, происходящих in vivo, проводились опыты in vitro для получения необходимых мутаций и определения свойств экспрессированного продукта гена. Для этого применялась рекомбинантная ДНК, в которой отсутствовал ген, который кодирует домен, гомологичный предшественнику ФРЭ. Такой рецептор связывает ЛНП, но не высвобождает его при закислении. Это блокирует рециклирование рецептора и ведет к его деградации после связывания лиганда.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
