Конечно, описанная выше способность таких белков, как а-лак-тальбумин, облегчать слияние никак не связана с их физиологической ролью. Однако имеются белки, функция которых состоит именно в ускорении слияния мембран. Это гликопротеины шиловидных структур оболочки вирусов животных. Вирионы этих вирусов имеют бислойную липидную оболочку, с которой связаны вирус-специфические белки, опосредующие слияние вирусов с клеткой. Некоторые вирусы сливаются с плазматической мембраной, другие связываются с рецепторами на плазматической мембране и проникают в клетку путем эндоцитоза. Эти вирусы сливаются с мембраной эндоцитозных пузырьков только после закисления их содержимого.
Белки шипов выполняют две функции: 1) с их помощью вирусная частица прикрепляется к мембране животной клетки, обычно к гликопротеину или гликолипиду: 2) вероятно, они взаимодействуют непосредственно с мембраной клетки-мишени, так что мембраны вируса и клетки-хозяина приходят в тесный контакт и их слияние ускоряется. У некоторых вирусов функции прикрепления и ускорения слияния выполняют разные белки, а у других - один и тот же белок. В качестве примера можно привести В-белок вируса везикулярного стоматита и гемагглютинин вируса гриппа, участвующие в обоих процессах. Каждый из этих белков представляет собой гомотример, состоящий из трех идентичных субъединиц. Белки были очищены и встроены в липосомы, которые приобрели способность как к прикреплению, так и к слиянию. Способность к слиянию в обоих случаях проявлялась только при слабокислых условиях, которые соответствовали значению рН внутри эндоцитозных пузырьков. Эта способность, по-видимому, определялась небольшими сегментами белков, находящимися вблизи N_конца. Синтетический пептид из 25 аминокислотных остатков, соответствующий N_концевой последовательности В-белка вируса везикулярного стоматита, проявляет рН-зависимую гемолитическую активность, сходную с таковой самого вируса. Как соотносится это наблюдение со свойствами G_белка, пока неясно.
Гемагглютинин вируса гриппа - наиболее полно охарактеризован ная гликопротеиновая структура
Этот белок связан с вирусной мембраной с помощью короткого трансмембранного домена на С-конце. Он синтезируется как единая полипептидная цепь, но при созревании претерпевает протеолитическое расщепление с образованием двух полипептидов, HAi и НА2, связанных дисульфидной связью. Участок, отвечающий за слияние, локализован на N_конце НА2. Он соответствует N_концу G_белка вируса везикулярного стоматита.
С помощью рентгеновской кристаллографии была определена трехмерная структура водорастворимого домена гемагглютинина. Этот домен получают с помощью расщепления бромелаином. Он представляет собой трнмер из - субъединиц, напоминает по форме стержень и выступает из мембраны на 135 А. Каждая субъединица имеет а-спиральный «стебель» с глобулярной «верхушкой», которая содержит рецепторыый участок для сиалогликосоединений.
Гидрофобный фузионный пептид спрятан между субъединицами тримера и находится на расстоянии 30 А от поверхности мембраны. Как известно, при низких рН третичная и четвертичная структуры белка необратимо изменяются. При рН 5,0 белок приобретает способность связывать липиды и детергенты и самоагретируется, что позволяет думать об экспонировании гидрофобного домена. По-видимому, это коррелирует с экспонированием фузионного пептида, который теперь может связаться с мембраной-мишенью, способствуя сближению обеих мембран и облегчая их слияние. Были выделены и получены in vitro мутанты с другими рН-оптнмумом и фузноинымн свойствами. Это подтверждает важность контактирования субъединиц при рН-зависимом конформационном изменении структуры белка и роль фузионного пептида. Гемагглютинин ацилирован жирными кислотами, которые, по-видимому, усиливают фузионную активность.
Суммируя все сказанное выше, можно сделать вывод, что, хотя физико-химические механизмы слияния мембран до конца не установлены, очевидно, что специфическое слияние мембран внутри клетки может осуществляться с помощью некоего белокзависимого процесса. Для этого должно произойти специфическое межмембранное взаимодействие, обеспечивающее прикрепление мембран друг к другу, и должен присутствовать мембранный белок, который при необходимости обеспечивает слияние. Для изучения свойств таких белков можно использовать белки, образующие шиловидные структуры вирусных частиц. Но могут применяться и другие модельные системы. Вероятно, семейство таких белков участвует в слиянии мембран как при экзоцитозе, так и при эндоцитозе.
5. Рецепторные системы бактерий обладают некоторыми свойствами, присущими и высшим организмам
Во всех клеточных ответах участвуют системы передачи сигнала, которые преобразуют событие, происходящее вне клетки, - связывание лиганда с рецептором, - в сложный внутриклеточный ответ. Мы рассмотрим системы передачи сигналов у бактерий, а далее суммируем данные по таким системам у животных клеток.
Бактерии реагируют на изменение концентрации различных растворимых веществ в окружающей среде. Свободноплавающие бактерии, например Е. coli, обладают способностью к хемотаксису и при увеличении содержания в среде специфических питательных веществ перемещаются вверх по градиенту их концентрации, к источнику питания. В этом процессе участвуют рецепторы цитоплазматической мембраны, которые связываются с «привлекательным» для бактерии растворенным веществом и индуцируют серию событий в цитоплазме, приводящих к вращению жгутиков. Сходным образом клетки Е. coli реагируют на уменьшение концентрации фосфата или азота, синтезируя белки, которые придают клеткам способность «улавливать» эти компоненты из окружающей среды. В этом процессе также участвуют специфические рецепторы цитоплазматической мембраны.
Такие системы ответа активно изучались в первую очередь с помощью генетических и молекулярно-биологическнх методов. Данные по гомологии аминокислотных последовательностей позволили идентифицировать два семейства белковых рецепторов прокариот.
Рецепторы, участвующие в хемотаксисе и влияющие на вращение жгутиков.
Рецепторы, опосредующие ответы, которые влияют на аппарат транскрипции и активность генов.
Изученные типы рецепторов поражают своим сходством с рецепторами, характерными для клеток высших организмов.
5.1 Рецепторы, ответственные за хемотаксис Е. coli
К этому семейству белков относятся четыре рецептора. Их часто считают продуктами четырех генов - tsr, tar, tap и trg. Например, Wr_белок связывается с аттрактантом серином, а также опосредует хемотаксис в ответ на репеллент лейцин. Наиболее полно изучен рецептор для аспартата, который связывается с аттрактантом аспартатом, а также с мальтозосвяззывающим белком. Все четыре рецептора содержат единственную полипептидную цепь. Данные об их первичной структуре позволяют предположить, что это трансмембранные белки, которые имеют по две пронизывающие мембрану а-спирали. Характер укладки рецептора для аспартата, представленный на рис. 9.12, согласуется с результатами экспериментов по слиянию генов, а также с генетическими и биохимическими данными. Биохимические свойства рецептора для аспартата свидетельствуют о том, что он, по-видимому, представляет собой тетрамер. Все четыре хемотаксических белковых рецептора имеют высококонсервативные С-концевые половины, составляющие цитоплазматические домены; N_концевые части, составляющие периплазматические домены, гораздо менее консервативны.
Рецептор для аспартата выполняет три разные функции.
1. Связывание аспартата, за которое ответствен N_концевой домен, обращенный в периплазму. Белки с укороченным цитоплазматическим доменом тем не менее связываются с аспартатом нормально.
2. Передача сигнала, в которой участвуют аминокислотные остатки трансмембранных спиралей; об этом свидетельствуют результаты замещения лизина в положении 19 на аланин в первой трансмембранной спирали. Полученный мутантный рецептор связывает аспартат, но не индуцирует ответной реакции, что, вероятно, обусловлено изменением конформации белковой молекулы. Показано также, что рецептор может связываться с аспар-татом и с мальтозосвязывающим белком одновременно, при этом ответы усиливают друг друга. Природа конформацнонного изменения в рецепторе, индуцируемого связыванием лиганда, неизвестна, но, по-видимому, это изменение затрагивает значительную часть полипептида. Механизм, с помощью которого рецептор влияет на «мотор», приводящий в движение жгутики, также неизвестен; установлено только, что в нем участвует С-концевой домен рецептора и он может быть связан с фосфорилнрованием одного из других белковых компонентов системы.
3. Адаптация, которая заключается в том, что система способна реагировать на увеличение концентрации лишь непродолжительное время; через несколько минут рецептор десенсибилизуется, т. е. адаптируется к новой концентрации аттрактанта. Но затем рецептор вновь приобретает способность реагировать на дальнейшие изменения концентрации аттрактанта. Частично это связано с метилированием и деметилированием рецептора по нескольким глутаминовым остаткам, расположенным в цитоплазматическом домене. Адаптация отсутствует у рецепторов с укороченным С-концом; эта мутантная форма реагирует на аспартат в течение всего времени, пока последний находится в среде.
В ходе многочисленных экспериментов была продемонстрирована кажущаяся независимость функциональных доменов, расположенных на N- и С-концах белка. Такие белки обладали хемотаксической активностью по отношению к серину. Подобные конструкции наблюдались также у семейства рецепторов пептидных гормонов животных клеток.
Из всего сказанного можно сделать следующие выводы.
Существует семейство трансмембранных рецепторов с родственными последовательностями.
Наличие у рецепторов разных функций предполагает, что у них имеются разные структурные и функциональные домены.
И высшие, и низшие организмы обладают системой передачи сигнала, в которую вовлечены другие цитоплазматические белки, вероятно каким-то образом модифицирующиеся благодаря конформационному изменению, которое претерпевает рецептор при связывании лиганда.
Система адаптируется к сигналу, т. е. может отвечать на него лишь непродолжительное время. Это свойство присуще многим системам клеточного ответа; его называют также десенсибилизацией.
5.2 Рецепторы, участвующие в активации транскрипции
Это второе семейство рецепторов обнаружено у множества бактерий, которые отвечают на сигнал активацией транскрипции отдельных генов. Во всех случаях система имеет два белковых компонента: 1) сенсор, или рецептор, и 2) регулятор. Все рецепторы, по-видимому, имеют сходную структуру. Они содержат две трансмембранные спирали в N_концевой половине молекулы. С-концевые последовательности представителей этого семейства, находящиеся на цитоплазматической стороне мембраны, в значительной степени гомологичны. Регуляторные белки, по-видимому, находятся в цитоплазме в растворимой форме. Вероятно, рецепторы каким-то образом модифицируют эти белки, и затем они прямо или косвенно активируют транскрипцию. Возможно, модификация состоит в фос-форилировании; об этом свидетельствуют данные, полученные при исследовании системы ответа на ограничение концентрации азота.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
