Физико-химическая характеристика белков термофильных микроорганизмов показывает, что они во многом гомологичны соответствующим белкам мезофилов: термофильные белки имеют такое же содержание участков с альфа-спиральной конфигурацией и бета-структурой и такое же число гидрофобных групп, как и аналоги из мезофильных организмов. Но в отличие от белков мезофилов, которые обычно денатурируются при температуре ниже 60°С, термофильные белки при повышении температуры от комнатной до 55 или 60° претерпевают, небольшие конформационные изменения, не сопровождаемые денатурацией.
Термофильные белки чаще всего содержат большое число неполярных боковых цепей, поэтому в результате стабилизации дополнительными гидрофобными взаимодействиями возникает повышенная термостабильность таких участков термофильных белков.
Термофильные белки более устойчивы к индуцируемой нагреванием агрегации, что следует из большей устойчивости к тепловой коагуляции цитоплазматических белков термофильных бактерий по сравнению с аналогичными белками мезофильных бактерий. Более низкая способность белков к агрегации связана с тенденцией к понижению изоэлектрических точек этих белков и повышению устойчивости их молекул к развертыванию, благодаря чему неполярные участки остаются скрытыми в глубине молекул
Термостабильность белков обусловлена также более низким содержанием цистеина и особенно вспомогательных сульфгидрильных групп, которые обычно располагаются на поверхности белка и поэтому легко подвергаются окислению.
Также известно, что ионы кальция могут стабилизировать ферменты не только у термофильных, но и у мезофильных организмов, и абсолютно необходимы для термостабильности. Образование дополнительных центров связывания кальция в случае термолизина и альфа-амилазы, очевидно, имеет отношение к повышенной термостабильности этих белков. Так, термостабильность термолизина при температурах приблизительно от 50 до 80°С повышается в результате стабилизации одного или двух участков ионами Са2+.
Степень стабильности белков также определяется специфическим положением в полипептидной цепи определенных аминокислот, поэтому огромное влияние на термостабильность молекулы белка может оказать замена в ней всего лишь одной аминокислоты в процессе различных мутаций генетического материала бактерии (Логинова Л.Г., 1977).
2.1.3 Небелковые стабилизирующие факторы
Некоторые ферменты, выделенные из термофилов, неустойчивы при оптимальной температуре роста данного организма. Это говорит о присутствии в клетках термофилов дополнительных стабилизирующих факторов. Такими факторами могут служить обычные клеточные компоненты, такие, как кофакторы, субстраты, мембраны и внутриклеточная среда, содержащая сильно заряженные макромолекулы, которые обеспечивают необходимую дополнительную стабилизацию ферментов.
Одним из самых наглядных примеров стабилизации фермента субстратом и модификаторами служит глутаминсинтетаза из В. stearothermophilus Этот фермент быстро теряет активность при 65°С, если в среде отсутствуют глутамат и ионы аммония. Глутаминсинтетаза стабилизируется также модификаторами, действующими по принципу обратной связи, особенно аланином, гистидином и ЦТФ. Для стабилизации внеклеточных гидролаз, например альфа-амилазы и термолизина требуется присутствие кальция. Для термостабильности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы В. coagulans необходимо наличие сильно заряженной окружающей среды.
2.1.4 Высокозаряженные макромолекулы внутри клеток
Термофильные бактерии синтезируют белки, которые обладают присущей им самим термостабильностью. Как отмечалось выше, многие ферменты, выделенные из облигатных или кальдоактивных бактерий, не являются стабильными при оптимальных и (или) максимальных температурах роста, хотя, несомненно, они более термостабильны, чем их мезофильные аналоги. Однако при изучении клеточных стенок факультативного термофила В. coagulans было показано, что отдельные гликолитические ферменты в неочищенных экстрактах этого организма, выращенного при 37 и 55°С, так же лабильны, как и ферменты из мезофильных организмов. Функциональным механизмом термофилии у факультативного термофила В. coagulans служит заряд внутриклеточных макромолекул, что подтверждается наличием у этого организма термолабильной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.
Заряженная внутриклеточная среда также имеет важное значение для выживания облигатных и кальдоактивных термофилов благодаря тому, что она может стабилизировать некоторые ферменты, обнаруживающие более низкую термостабильность при оптимальной или максимальной температуре роста.
Концепция стабилизации белков in vivo посредством заряженных макромолекул принята в качестве правдоподобного объяснения механизма термофилии у В. coagulans по следующим причинам:
1) в неочищенных экстрактах клеток, выращенных при любой из двух указанных температур, присутствуют заряженные макромолекулы, которые, однако, из-за разбавления в условиях in vitro не могут полностью проявить своего защитного действия на ферменты. Тем не менее имитация существующей в условиях in vivo заряженной среды путем добавления к клеточным экстрактам (NH4)2S04 или NaCl приводит к полному предохранению фермента от инактивации;
2) в случае очищенной до кристаллического состояния ГФДГ, т. е. в условиях, когда отсутствует взаимодействие фермента с другими макромолекулами, заряд сам по себе стабилизирует фермент;
3) микробная клетка представляет собой высокоорганизованную систему, содержащую лишь незначительное количество свободной внутриклеточной воды, таким образом высокозаряженные макромолекулы играют важную роль в механизме термостабилизации белков в интактной клетке. В условиях in vivo заряд макромолекул достаточен для стабилизации относительно термолабильных ферментов облигатных и кальдоактивных бактерий (Кашнер Д.,1981)
3. МЕХАНИЗМЫ ВЫЖИВАНИЯ БАКТЕРИЙ ПРИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ЗНАЧЕНИЯХ РН
Давно установлено, что концентрация водородных ионов играет роль фактора, определяющего границы существования живой матери, и является одним из важнейших факторов, влияющих на рост и размножение микроорганизмов. Концентрация водородных ионов воздействует на ионное состояние, а следовательно, и на доступность для организма многих метаболитов и неорганических ионов: с одной стороны, концентрация ионов водорода непосредственно влияет на клетку, ее электрический заряд, состояние мембраны, возможность протекания окислительно-восстановительных реакций, с другой стороны, -- косвенно, определяя ионное состояние металлов, кислот, их доступность и токсичность. Невозможно переоценить ее влияние на стабильность и функции макромолекул в биологических процессах. Значения реакции среды различных природных вод и растворов, где развиваются микроорганизмы (от рН 1 -- 2 в кислых источниках и рудничных стоках до рН 10 в содовых озерах), покрывают почти весь теоретически возможный диапазон значений рН (0-- 14). Большая часть организмов наилучшим образом развивается при концентрации ионов водорода, близкой к рН=7, что характерно для многих природных сред. Очень высокие (кислая реакция) или очень низкие (щелочная реакция) концентрации водородных ионов обычно токсичны для большинства организмов. В общем, предельные концентрации ионов водорода, выше и ниже которых известные в настоящее время организмы прекращают рост и размножение, приблизительно равны рН=1, что отмечено лишь для немногих бактерий и грибов, и рН=11, что наблюдается в случае некоторых водорослей, грибов и бактерий. Большинство организмов живет при рН от 4 до 9, причем их оптимальный рост наблюдается в среде, близкой к нейтральной.
Каждому микроорганизму свойствен определенный интервал кислотности или щелочности среды, в котором возможен его активный рост. В зависимости от положения оптимального рН развития различают ацидофильные, нейтрофильные и алкалифильные микроорганизмы. Большинство естественных местообитаний имеет нейтральный или близкий к нему (слабокислый или слабощелочной) рН. Так, если рН пресной воды равен 7,0, то реакция морской воды скорее слабощелочная (рН 7,5 -- 8,0).
В почве рН может быть достаточно низким, до 4,0. В таких местообитаниях развиваются организмы, называемые алкали - или ацидотолерантными и умеренными алкали- или ацидофилами. Тем не менее встречаются как природные, так и антропогенные местообитания, которые можно отнести к экстремальным: экстремально кислые с рН < 4,0 и экстремально щелочные с рН >10,0. Развивающиеся там микробные сообщества представлены соответствующими экстремофильными микроорганизмами. Примером ацидофилов служат молочнокислые, уксуснокислые бактерии, многие грибы (Бухарин О.В., 2005).
Меньше примеров алкалифильных организмов, требующих для своего роста значений рН до 10 и выше (уробактерии и многие цианобактерии). Среди бактерий обнаружено несколько видов, устойчивых к щелочной среде (рН 8,5 и выше). Сюда следует отнести Bacillus pasteurii -- бактерию, расщепляющую мочевину и хорошо растущую при реакции среды, близкой к рН 11. В. alcalophilus, выделенная из сточной воды, способна расти в диапазоне рН 9--11,5. Выделены и другие бациллы, очень устойчивые к щелочной среде. Цианобактерии могут развиваться в природной среде с рН 7,5--10, некоторые из этих бактерий имеют оптимум рН 10 (Покровский В.И., 1999).
Природные среды, имеющие рН, близкий к обычному нижнему пределу (3--4), встречаются довольно часто. Однако среды с рН более низким, чем 3--4, чрезвычайно редки. Примерами среднекислых сред обитания служат многие озера, некоторые истощенные почвы и кислые болота. Такие естественные среды обеспечивают развитие многих эукариотических водорослей, бактерий, растительных и животных форм. Из этих сред было выделено множество малоизвестных бактерий: Bactoderma, Caulobacter, Microcyclus, Planctomyces и Thiovobium, обнаруженных в сфагновых болотах с рН от 3 до 5. Представители уксуснокислых бактерий растут в пределах рН от 3 до 5. Интересным примером является Acetobacter acidophilum prov. sp., у которого оптимум роста находился при рН 3, нижний предел роста при рН=2,8, а верхний--при рН=4,3.
3.1 Основные механизмы выживания
Концентрация водородных ионов в окружающей среде оказывает целый ряд прямых и косвенных воздействий на метаболизм и стабильность клетки. себе Ионы водорода (Н+) обладают уникальными свойствами, отличающими их от других катионов. Они представляют собой протоны, лишенные электронов. В водных растворах они быстро гидратируются и образуют ион гидроксония Н30+. В кислой среде преобладают ионы гидроксония, которые реально существуют в форме гидратированных ионов, причем степень гидратации зависит от концентрации ионов гидроксония и температуры.
Микроорганизмы, обладающие способностью расти и размножаться при низких или высоких значениях рН, имеют определенные механизмы, обеспечивающие их выживание. Преимуществом данных микроорганизмов является то, что при таких условиях резко ограничивается конкуренция других организмов. Например, ацидофил Thiobacillus thiooxidans может использовать в кислой среде ионы двухвалентного железа, которые при рН выше 5 самоокисляются, вследствие чего этот производящий энергию субстрат становится недоступным для данного организма. При высоких значениях рН алкалофил Bacillus pasteurii специфически нуждается в аммиаке для транспорта и окисления таких субстратов, как глутаминовая кислота, изолейцин, треонин, а также промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот -- ацетата, а-кетоглутарата и малата. В этом случае преимущество существования В. pasteurii при высоких значениях рН заключается в том, что щелочная среда обеспечивает доступность NH3 для организма.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
