Увеличение содержания ДНК в клетке служит одним из факторов ее радиорезистентности. Это может быть обусловлено либо увеличением числа нуклеоидов в клетке, либо ее полиплоидностью. Нитевидная форма резистентных клеток Е. coli позволяет предполагать, что в них реализуется первый механизм. Но содержание ДНК в клетках этих штаммов практически не отличается от такового в клетках дикого типа.

Определение содержания GC-nap в ДНК восьми видов бактерий показало, что существует обратная зависимость между GC-содержанием и резистентностью клеток к рентгеновским лучам. В то же время между GC-содержанием и резистентностью к УФ-облучению наблюдается прямая зависимость. Такая корреляция утрачивает какой бы то ни было смысл в случае М. radiodurans, резистентного к обоим типам излучения; однако она может иметь некоторое значение при отсутствии у бактерий эффективных систем репарации. Действительно, ДНК М. radiodurans характеризуется тем же нуклеотидным составом, что и ДНК штаммов Pseudomonas, исключительно чувствительных к ионизирующей радиации (Покровский В.И., 1999).

6.1.1 Механизмы репарации ДНК

В основе радиорезистентности бактерий лежат разнообразные внутриклеточные процессы, участвующие в репарации поврежденной ДНК. Большую ценность для исследования этих процессов представляет наличие хорошо охарактеризованных мутантных штаммов, радиационная чувствительность которых варьирует в чрезвычайно широких пределах.

При помощи генетических скрещиваний были получены двойные и тройные мутанты дрожжей, у которых репаративная активность полностью отсутствует. Сравнительное исследование штамма дикого типа и сверхчувствительных двойных и тройных мутантов S. сеrevisiae показало, что если нормальный штамм довольно легко переносит образование в ДНК почти 16 000 димеров (37% выживания), то двойные и тройные мутанты остаются резистентными в присутствии не более 50 и 1 димера соответственно. Пониженная резистентность таких двойных и тройных мутантов служит убедительным свидетельством в пользу существования различных путей репарации радиационных повреждений.

В зависимости от того, участвует ли видимый свет в модификации повреждений ДНК, репарацию можно подразделить на световую и темновую. Конкретно под световой репарацией понимается феномен фотореактивации, впервые описанный у актиномицетов. Механизм фотореактивации действует только на пиримидиновые димеры. В этом процессе участвует фермент фотореактивации, который связывается с димерами. Образующийся фермент-субстратный комплекс активируется видимым светом, что приводит к мономеризации димеров in situ. Таким образом, летальный эффект УФ-облучения существенно снижается, если облученные клетки подвергаются затем воздействию видимого света с длинами волн от 360 до 420 нм (см. рис. 6.1).

Рис. 6.1 Световая репарация ДНК

Фотореактивация служит мощным инструментом исследования летальных и мутационных повреждений, так как их репарация под влиянием света может быть использована в качестве критерия для решения вопроса о том, обусловлена ли инактивация ДНК образованием пиримидиновых димеров.

К другому типу реактивации клеток видимым светом относится его защитное действие. В этом случае увеличение выживаемости клеток наблюдается при освещении их видимым светом перед УФ-облучением. Этот феномен объясняют тем, что видимый свет индуцирует задержку клеточного деления. В результате такой задержки остается больше времени для репарации повреждений, вызываемых УФ-облучением (см. рис. 6.2).

Рис. 6.2 Зависимость выживания клеток бактерий от величины облучения

Под «темновой репарацией» понимают репарацию без участия света. В настоящее время известны две системы такого типа: эксцизионная репарация и пострепликативная рекомбинационная репарация. Репарация первого типа требует присутствия ферментов, которые узнают нарушения структуры ДНК, удаляют затронутые участки, замещая их нормальными нуклеотидными последовательностями, и, наконец, восстанавливают первоначальную структуру ДНК, замыкая полинуклеотидную цепь (см. рис. 6.3).

Рис. 6.3Темновая репарация ДНК

Действие разнообразных инактивирующих агентов на клетки может приводить к возникновению в ДНК целого ряда различных повреждений. Детальное изучение системы эксцизионной репарации стало возможным благодаря наличию радиационно-чувствительных мутантов, с помощью которых удалось выделить и охарактеризовать специфические ферменты, принимающие участие в разных стадиях этого процесса. У Е. coli имеется, по крайней мере, четыре таких этапа. На первом этапе происходит разрыв цепи ДНК вблизи повреждения под действием эндонуклеазы, узнающей нарушения структуры ДНК. Такая УФ-специфическая эндонуклеаза была выделена из Micrococcus luteus и Е. coli. За разрывом цепи ДНК следует удаление пиримидиновых димеров, осуществляемое экзонуклеазой. Удаление димеров сопровождается дополнительной деградацией ДНК с образованием брешей, размеры которых варьируют от 20 до 400 нуклеотидов. Затем бреши заполняются с помощью ДНК-полимеразы, использующей в качестве матрицы интактную комплементарную цепь ДНК. Заключительный шаг в этой последовательности событии состоит в восстановлении целостности полинуклеотидной цепи в результате сшивания разрыва лигазой.

Второй тип темновой репарации -- пострепликативная рекомбинационная репарация -- был впервые описан Говард-Флендерсом. Как указывает само название, эта репаративная система устраняет повреждения в ДНК после того, как произошла ее репликация.

Клеточная система репликации способна «обходить» некоторые из димеров в матричной цепи ДНК, оставляя в растущей цепи бреши, расположенные напротив каждого из них. Число брешей, возникающих таким путем, примерно соответствует числу димеров в ДНК. В результате процесса, сходного с рекомбинацией и включающего обмен между сестринскими нитями, образуется ДНК с двумя интактными цепями. Обнаружено, что при заполнении брешей происходит обмен между облученной родительской цепью ДНК и необлученной дочерней цепью. Установлено, что для образования интактных, не содержащих димеры молекул ДНК, заполнение брешей не обязательно, вместо этого концентрация димеров может просто постепенно снижаться в ходе последовательных циклов репликации ДНК после облучения (Покровский В.И., 1999).

6.1.2 Механизмы резистентности Micrococcus radiodurans

Исключительная резистентность М. radiodurans вызывает особый интерес, исследование кривых выживания выявило очень длинное плечо, выходящее за пределы 1,5 мрад. Этот организм обладает наивысшей резистентностью к гамма-излучению по сравнению со всеми изученными до сих пор микроорганизмами. Для него характерна также необычайная резистентность к УФ-излучению, превышающая резистентность всех исследованных в этом отношении бактерий. Кривая выживания при УФ-облучении состоит из трех компонентов: очень длинного плеча, доходящего до 9000 эрг-мм-2, экспоненциальной части и выраженного «хвоста», который начинается при 25 000 эрг-мм-2 и тянется значительно дальше 50 000 эрг-мм-2. Наличие большого плеча указывает на существование исключительно эффективной клеточной системы репарации.

Имеются различные причины его резистентности к УФ-облучению. В качестве таковых рассматривались экранирование ДНК другими поглощающими соединениями; резистентность, присущая самой ДНК в силу особенностей ее структуры; высокая эффективность репаративных механизмов, а также высокая степень плоидности. Для того чтобы сделать выбор между этими возможностями, исследовались кривые выживания, образование тиминовых димеров как функция дозы УФ-излучения, нуклеотидный состав ДНК и кинетика синтеза ДНК после облучения. В ДНК М. radiodurans при УФ-облучении индуцируется приблизительно втрое меньше тиминовых димеров, чем в ДНК Е. coli. Частично эта разница в димеризации обусловлена различиями в нуклеотидном составе ДНК этих микроорганизмов: у М. radiodurans отношение G + C/A-t-T в 1,6 раза больше, чем у Е. coli (Белозерский, Спирин, 1960). Возможно, имеет значение также разница в поглощении УФ-излучения в расчете на одну клетку. Показано, что эта величина несколько меньше для М. radiodurans, чем для Е. coli. Неизвестно, полностью ли трехкратная разница в димеризации тимина обусловлена различиями в нуклеотидном составе ДНК и поглощении УФ-излучения в расчете на одну клетку. Во всяком случае сам факт уменьшения числа образующихся димеров совершенно недостаточен для объяснения более высокой радиорезистентности М. radiodurans.

При сравнении влияния УФ-облучения на последующий синтез ДНК в клетках М. radiodurans и Е. coli выяснилось, что одинаковая по продолжительности задержка репликации ДНК возникает у них тогда, когда клетки М. radiodurans облучают в дозе, величина которой в 20 раз превышает соответствующую величину для Е. coli. Это различие обусловлено очень высокой эффективностью удаления димеров тимина у М. radiodurans. Димеры тимина вырезаются из клеточной ДНК до возобновления ее репликации. Механизм вырезания пиримидиновых димеров у этой бактерии настолько эффективен, что гибель клеток происходит по каким-то другим причинам, к числу которых может относиться, например, модификация дезоксицитидина и белков.

Повышенная резистентность М. radiodurans к летальному действию облучения явно сопровождается его повышенной резистентностью к индуцированному мутагенезу. Для некоторых радиационно-чувствительных мутантов Е. coll было показано, что характерная для них высокая мутабильность сопутствует их повышенной чувствительности к летальному действию облучения. Ни штамм дикого типа, ни температурно-чувствительный мутант не дают мутаций при УФ-облучении в такой высокой дозе, как 15 000 эрг. Напротив, у Е. coli индуцирование мутаций наблюдается при облучении в дозе 100 эрг.

При облучении в дозе 110 крад, вызывающей значительные физико-химические изменения в ДНК Е. coli В/г, выживание М. radiodurans составляет 100%. Процесс репарации радиационных повреждений у М. radiodurans исключительно точен и не допускает ошибок; этот факт заслуживает особого внимания и может иметь значение для эволюции организмов. Хотя большинство микроорганизмов не способно репарировать двухцепочные разрывы ДНК, М. radiodurans обладает способностью к репарации таких разрывов, индуцируемых гамма-лучами, чем и объясняется его высокая резистентность к ионизирующему излучению. Ионизирующее излучение индуцирует у М. radiodurans освобождение связанной с клеточной поверхностью экзонуклеазы. Это явление можно рассматривать как модель освобождения связанных с мембранами репаративных ферментов после облучения. Более подробное исследование энзимологии репарации ДНК у М. radiodurans было бы полезным для углубления понимания молекулярных основ радиорезистентности (Кашнер Д., 1981).

7. РОЛЬ СТРЕССОСОМ КАК ФАКТОРОВ ВЫЖИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

О кризисных явлениях в окружающей среде большинству бактерий сигналит особый центр. Этот центр чаще всего является крупной молекулой и назван «стрессосомой». Как правило, бактерия имеет в своём составе около 20 стрессомом, и, хотя ученые знают, что они играют важную роль в генерации клеточного ответа на стрессовые ситуации, сложности в этом процессе не были полностью изучены до сих пор, о кризисных явлениях в окружающей среде большинству бактерий сигналит особый центр. Этот центр чаще всего является крупной молекулой и назван «стрессосомой». Как правило, бактерия имеет в своём составе около 20 стрессомом. Бактерия оказывается в опасной ситуации, например, если температура и соленость среды достигают своего опасного уровня. В таком случае сигнал передается с поверхности клетки внутрь, предупреждая бактерию об угрозе выживанию.

Используя последние достижения электронной микроскопии авторы исследования, результаты которого были опубликованы в журнале Science, отмечают, что стрессосомы, получая сигнал опасности, формируют ответ в виде отделения нескольких белков. Эта белковая структура провоцирует серию сигналов внутри клетки, позволяющих ей адаптироваться и выжить в новой среде.

Стрессосомы клетки являются важнейшими элементами для защиты клетки, поскольку они позволяют очень быстро реагировать на опасность. Цепные реакции, происходящие в результате их активации, позволяют бактерии адаптироваться к изменениям в её окружающей среде почти мгновенно. Каскад событий внутри бактериальной клетки, который возникает вследствие сигнала стрессосомы, заставляет конкретные гены внутри клетки усиливать процесс трансляции. Это означает, что некоторые гены внутри клетки включаются в момент опасности и вызывают увеличение количества определённых белков. Именно такие изменения в клетке позволяют ей выживать во враждебных ей условиях (Марлз Дж., Грант Т., 2008).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

Таким образом, в завершение данного курсового проекта, можно подвести обобщающие выводы.

Были рассмотрены причины, по которым одни микроорганизмы способны размножаться при пониженных температурах, а другие даже нуждаются в таких условиях. Модификация мембранных липидов, а следовательно, и изменения в функционировании мембран представляют собой важный аспект температурной адаптации. Этот аспект особенно интересен в свете рассмотрения форм жизни, которые могли бы существовать на гигантских планетах, где условия, более или менее приемлемые для жизни, возможны лишь в газообразных областях.

Способность некоторых микроорганизмов жить при высоких температурах уже давно привлекла внимание биологов. Температурная адаптация микроорганизмов обусловлена изменениями в скоростях метаболизма, а также в структуре мембран, рибосом и отдельных белков. Наиболее важными для адаптации к высоким температурам являются изменения в структуре белков. При тех высоких температурах, при которых растут термофилы, многие их ферменты сохраняют как активность, так и регуляторные свойства.

Многие микроорганизмы способны размножаться в интервале значений рН, в котором их внутриклеточные ферменты не функционируют. Микроорганизмы могут существовать при концентрациях водородных ионов, различающихся на несколько порядков; отдельные микроорганизмы растут при рН 10 и даже при более высоких. Несмотря на то что рН окружающей среды может меняться, внутри своих клеток эти организмы поддерживают постоянную кислотность. Структуры на поверхности клеток у таких организмов должны быть приспособлены к крайним значениям рН.

Экстремальные галофилы занимают особое место среди микроорганизмов, существующих в экстремальных условиях, поскольку они представляют собой пример полной (и внешней, и внутренней) адаптации к очень высоким концентрациям солей, а также потому, что они обладают уникальными биохимическими свойствами. С недавних пор стало ясно, что организмы, живущие при высоких концентрациях растворенных веществ или способные размножаться в широком диапазоне концентраций, представляют собой крайне увлекательный объект исследования.

Многие микроорганизмы сохраняют жизнеспособность в течение долгого времени в отсутствие воды и начинают размножаться, как только она снова становится доступна для них. Хотя для своего размножения микроорганизмы нуждаются в определенном уровне содержания воды, она не требуется им для выживания.

Токсичность тяжелых металлов представляет собой проблему скорее для человека, чем для микроорганизмов, которые научились по-разному приспосабливаться к таким веществам. Микроорганизмы способны осуществлять трансформацию тяжелых металлов в окружающей среде: выщелачивать металлы из руд в кислых рудничных стоках, изменять валентность металлов, как, например, при трансформации ртути в более или менее токсичные формы, а также при образовании таких особых форм скоплений металлов, как марганцевые конкреции.

Микроорганизмы сильно отличаются друг от друга по своей устойчивости к радиации. Многие из них способны выдерживать дозы радиации, летальные для других форм жизни. Подобная устойчивость вызвана рядом факторов, наиболее важным из которых представляется способность микроорганизмов к репарации их ДНК, поврежденных облучением. Многообразие способов, при помощи которых микроорганизмы противостоят радиации, может сделать их последними обитателями на Земле или, напротив, первыми поселенцами на Земле, разрушенной атомной войной.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Асонов Н.Р. Микробиология / Н.Р. Асонов. - М.: Колос, 1980. - 312 с.

2. Камшилов М. М. Эволюция биосферы / М.М. Камшилов. - М.: Наука, 1974. - 254 с.

3. Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях. Пер. с англ. / Д. Кашнер. - М.: Мир, 1981. - 511 с.

4. Логинова Л.Г. Новые формы термофильных бактерий / Л.Г. Логинова, Л.А. Егорова. - М.: Наука, 1977. - 175 с.

5. Лях С.П. Адаптация микроорганизмов к низким температурам / С.П. Лях. - М.: Наука, 1976. - 160 с.

6. Марлз Дж., Грант Т., Делюмье О. Молекулярное строение стрессосом // Science, 2008. №3 C. 92 - 96

7. Радчук Н.А. Ветеринарная микробиология и иммунология / Н.А. Радчук, Г.В. Дунаев, Н.М.Колычев и др. - М.: Агропромиздат, 1991. - 383 с.

8. Покровский В.И. Микробиология / В.И. Покровский, О.Н. Поздеев. - М.: ГЭОТАР, 1999. - 1200с.

9. Бухарин О.В. Механизмы выживания бактерий / Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. и др. - М.: Медицина, 2005. - 367 с.

10. Заварзин Г.А. Природоведческая микробиология / Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. - М.: Книжный дом «Университет», 2001. - 256 с.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7