Слово «коагуляция» описывает в данном случае ситуацию, когда очень мелкие частицы вынуждены сцепляться друг с другом. Заряд на частицах нейтрализуется при добавлении поливалентных ионов, несущих противоположный заряд, вследствие чего наступает их коалесценция (слипание). Довольно долго в этих целях использовали неорганические соли. В последние годы получили распространение органические полиэлектролиты.
Термином «флокуляция» описывается образование значительно более рыхлых агрегатов, в которых флокулирующий агент выполняет роль мостикообразова- теля между частицами. Флокулирующие агенты включают в себя различные природные полимеры, такие, как желатина, и большое количество синтетических полимеров. Полимеры могут быть электролитами или неэлектролитами. Неорганические ионы не могут вызывать флокуляцию, хотя они могут быть использованы для нейтрализации зарядов частиц и в этом отношении способствовать флокуляции. Органические полиэлектролиты могут вызывать одновременно и коагуляцию и флокуляцию. Методы коагуляции и флокуляции применяют при работе с цельными микробными клетками, остатками клеток после лизиса и растворимыми белками.
2.1 Цельные клетки
При выделении ферментов флокулянт, если он присутствует в системе, не должен взаимодействовать с внеклеточными ферментами. При промышленном получении внеклеточной протеазы из Bacillus subtilis успешное применение нашли синтетические полиэлектролиты как вспомогательное средство, облегчающее отделение микробных клеток на фильтр-прессах. Поскольку флокулянт связывается с клетками, он может при последующем разрушении клеток для выделения ферментов войти в контакт с этими ферментами.
Проблеме коагуляции и флокуляции микробных клеток посвящено весьма мало исследований, за исключением работ, направленных на решение частных задач в пивоварении. Nakamura со ставил перечень основных требований, которые должны предъявляться к реагентам, предназначенным для применения в качестве коагулянтов или флокулянтов микробных клеток. К ним относятся: низкая стоимость, низкая доза применения и отсутствие резкого влияния на изменение рН. Среди неорганических веществ в качестве потенциальных коагулянтов было испытано множество агентов, включая квасцы, соли железа и кальция. Хлорид кальция (0,1--0,5 %) применялся с гидроокисью натрия (0,2--0,8 %) для того, чтобы обеспечить поддержание рН смеси на уровне 8,0--9,5. Эффективным агентом при этом оказалась гидроокись кальция, вызывающая коагуляцию и копреципитацию (совместное осаждение). Кальций может быть удален из концентрированной клеточной массы путем добавления разбавленной кислоты. Особенно эффективными оказались титановые соли в концентрации около 0,01 % для дрожжей, бактерий и микроводорослей. Это связано с четырехвалентным зарядом иона титана.
Была изучена флокуляция различных бактерий катионным полиамином и положительно заряженными микроскопическими волокнами алюминия. Количество алюминия, потребного для флокуляции Е. coli, составляло около одной десятой от того, что требовалось в случае Lactabacillus deilbruckii. Эффективность флокуляции зависела от температуры, физиологического «возраста» культуры, характера суспендирующей среды и особенно от фактических усилий сдвига, воздействовавших; на клетки перед флокуляцией.
2.2 Остатки клеток и белки
Получающиеся после разрушения микробных клеток (для выделения внутриклеточных ферментов) остатки клеточной оболочки обычно подлежат удалению из смеси до того, как она будет подвергнута фракционированию с целью получения различных белковых компонентов. Остатки клеток при механическом разрушении последних колеблются в размерах от нескольких микрон до долей микрона и поэтому трудно подвергаются извлечению из смеси. На помощь в этом случае приходят флокуляция и коагуляция клеточных остатков. Однако весьма существенно, что такие методы обработки суспензий приводят к переводу в нерастворимое состояние также и внутриклеточных ферментов. В отношении седиментации клеточных остатков эффективными коагулянтами оказались квасцы. Однако они переводят белок в нерастворимое состояние с образованием мелких, медленно оседающих, нерастворимых флокул.
Флокуляция или коагуляция ферментов с целью получения нерастворимых белковых агрегатов представляет собой достойную альтернативу классическим методам осаждения, которые требуют высоких концентраций реагентов.
На протяжении ряда лет с целью выделения внеклеточных ферментов из культуральных жидкостей использовалась дубильная кислота. В концентрациях 0,1 --1,0 % она образует легко фильтрующиеся осадки. Флокулы содержат достаточно устойчивые ферменты и могут быть промыты ацетоном для удаления дубильной кислоты. В случае применения таких носителей, как крахмал (2-- 5 %), при высушивании флокул может быть достигнуто 100-кратное увеличение концентрации ферментов. Непосредственное высушивание в отсутствии носителя обеспечивает 500- кратное увеличение концентрации. Флокулы обладают тем недостатком, что трудно подвергаются растворению.
3. Центрифугирование
Отделение твердых частиц от жидкостей представляет собой основную операцию в процессе выделения ферментов. Оно включает выделение клеток из культуральной жидкости, удаление клеточных остатков, сбор осадка и выделение адсорбентов белка из белоксодержащей надосадочной жидкости. Общепринято также включать в эту операцию отделение растворенных макромолекул от растворителя с помощью ультрацентрифугирования.
3.1 Сигма-анализ
Определенные трудности при сепарировании биологических частиц центрифугированием проистекают чаще всего из недостаточного понимания принципов процесса седиментации частиц в гравитационном поле. Эффективность центрифугирования повышается при увеличении диаметра частиц, разности между плотностями частицы и жидкости и при уменьшении вязкости жидкости. Эффективность также возрастает при повышении угловой скорости, увеличении радиуса центрифугирования, увеличении объема жидкости и уменьшении толщины слоя жидкости, подвергаемой центрифугированию. Однако биологические частицы характеризуются низкой плотностью и очень малыми размерами. Они также могут находиться в среде, которая благодаря присутствию растворенных твердых частиц обладает высокой вязкостью и повышенной плотностью.
В условиях лабораторий указанные неудобства могут быть преодолены путем применения центрифуг с высокой угловой скоростью. Однако эти центрифуги имеют очень малую производительность и работают периодически с точки зрения подачи в них суспензии и извлечения надосадочной жидкости и сконцентрированных твердых частиц. В случае центрифуг промышленного типа повышение производительности за счет увеличении радиуса центрифугирования не может быть достигнуто, так как механические напряжения возрастают пропорционально квадрату радиуса. Поэтому конструкция машины при увеличении радиуса ротора быстро становится небезопасной для применения.
Увеличение вместимости корзины центрифуги и непрерывное пропускание через нее центрифугируемой жидкости ограничивает величину безопасной угловой скорости. Эта величина также ограничивается, если твердый осадок подлежит разгрузке непосредственно в ходе операции, поскольку значительное влияние на угловую скорость оказывает степень дебаланса. Исходя из этих ограничений, промышленность создала ряд центрифуг, применимых к переработке продуктов биологической природы. Но только лишь некоторые из них оказались пригодными для выделения ферментов, так как чрезвычайно ограничивающим фактором в этом отношении являются свойства системы жидкость -- «твердая» частица. Для сепарации микробных клеток, остатков животных и микробных клеток и различных типов осадков применяются главным образом три типа центрифуг: трубчатые, многокамерные и дисковые. Меньшее, хотя и очень важное, применение находят спиральные центрифуги, центрифуги с твердой корзиной и ультрацентрифуги.
3.2 Центрифуги с роторами трубчатого типа
Цилиндрический ротор подвешивается при помощи гибкого вала к находящемуся в головке центрифуги мотору или воздушной турбине. Такая конструкция снижает нагревание ротора по сравнению с тем, что имеет место при нижнем расположении привода. Ротор установлен в подшипниках скольжения из мягкого металла. Для этой цели обычно применяется латунь, и хотя теоретически контакт между обрабатываемой жидкостью и подшипниками и данном типе машин не должен иметь места, тем не менее в тех случаях, когда обработке подвергаются растворы сульфата аммония, может происходить явная контаминация их медью. Подшипники скольжения из сплава Вууда являются в этом плане относительно надежной альтернативой при более высокой или более низкой частоте вращения в машинах небольших масштабов. Ослабление таких подшипников дает возможность ротору возвращаться в центрированное положение во время любого временного разбалансирования и обеспечивает более высокую частоту вращения по сравнению со всеми другими типами центрифуг, за исключением зональных ультрацентрифуг. В случае лабораторной модели центрифуги Sharpies IP (Pennwalt) с диаметром ротора 4,5 см и частотой вращения 50 ООО об/мин развивается усилие в 62 500 g, а в случае модели 6Р (диаметр ротора 10,8 см, частота вращения 15 500 об/мин) -- 14 000 g. Модель IP оснащена воздушной турбиной, модель GP приводится в действие с помощью электродвигателя.
Жидкость перекачивается в ротор через донный штуцер, омывая при этом нижние подшипники. По море продвижения жидкости вверх по ротору происходит седиментация находящихся в ней твердых частиц на стенках ротора. Освобожденная от твердых включений жидкость отбрасывается центробежной силой из ротора в его верхней части и собирается в окружающую ротор чашу. Обе модели при обработке суспензий микробных, животных и растительных клеток, большинства суспензий остатков микробных клеток, а также суспензий твердых белковых адсорбентов дают прекрасное их осветление, а также прекрасное обезвоживание полученных твердых осадков. С помощью лабораторной модели можно также отделить от жидкой фазы белковую фракцию, осажденную солями или полимерами. Однако отделение невозможно, если плотность жидкости очень высока.
Применение пластиковых гильз ускоряет удаление осадка по сравнению с тем, как это происходит в случае извлечения из машины самого центрифужного ротора. Время оборачиваемости 15-- 20 мин. Однако количество накапливаемого твердого осадка при этом незначительно -- около 4 кг (по влажной массе).
Вывод жидкости из центрифуги влечет за собой ценообразование и генерирование аэрозоля. Последний может представлять опасность. Поэтому все машины, занятые в производстве ферментов, должны позволять осуществлять их монтаж внутри ограждающего кожуха. Аэрация жидкой фазы при разгрузке центрифуг может повреждать находящиеся в ней ферменты, особенно когда они содержат активные сульфгидрильные радикалы. В этих случаях может оказаться полезным применение противопенных и защитных в отношении сульфгидрильных групп агентов.
Следует иметь в виду, что при входе обрабатываемой суспензии в центрифугу очень высокое угловое ускорение может привести к дезагрегированию имеющихся в ней конгломератов и элементов осадка и, следовательно, к уменьшению вероятности удаления твердых частиц из жидкости. Когда двигатель выключается, жидкость, остающаяся в роторе центрифуги, будет вытекать из нее через донный штуцер и может выносить с собой определенное количество твердых частиц. Поэтому не следует смешивать эту часть жидкости с уже осветленной.
Несмотря на указанные недостатки, такие простые и доступные машины, как описанные центрифуги, являются наиболее пригодными и универсальными для разделения жидкой и твердой фаз при получении ферментов в полупромышленных условиях.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
