7.4 Обработка отходов

Обязанность обеспечить безопасность персонала предприятий должна сопровождаться такими же мероприятиями в отношении зашиты всех других людей от какого бы то ни было влияния всех видов отходов, сбрасываемых с предприятий. Отводимый воздух должен подвергаться фильтрации и контролироваться на чистоту. Для замены фильтров и их обезвреживания должны быть разработаны безопасные процедуры. Твердые отходы подлежат автоклавированию, а затем обычно выбрасываются на свалку. Обработка жидких отходов отчасти определяется местоположением предприятия. Местные инструкции регламентируют главным образом такие факторы, как благоприятное биологическое потребление кислорода и меры по исключению из стоков солей, обладающих, например, коррозионным действием. Присутствие в сточных водах микробных клеток не обязательно будет представлять собой опасность, так как содержание их в обычных сточных водах бывает довольно высоким. Однако отдельные виды или даже штаммы микроорганизмов могут оказаться опасными или необычными для бытовых стоков данного района. Влияние же на характер стоков и на их безопасность (или опасность) таких факторов, как внутриклеточные материалы и эндотоксины, выяснено пока только частично.

7.5 Безопасность и безвредность продукта

Стандарты, относящиеся к безопасности и безвредности продуктов, различны в разных странах. Они основываются в большинстве случаев па долгосрочных наблюдениях за применением тех или иных продуктов. Американский перечень под кодовым названием GRAS (препараты, большей частью оцениваемые как безопасные) точно отражает то положение, что конкретный препарат, который в момент своего появления был отнесен к безопасным, в определенное время может оказаться небезопасным. Практическим выводом из законов о безопасности продуктов является тот факт, что лишь ограниченное число микробиологических источников ферментов допускается к применению в промышленности в том случае, если получаемые ферментные препараты предназначаются для использования в продуктах питания. Дополнения к перечню GRAS допускается вносить только после длительных испытаний соответствующих препаратов. Это означает, что большие капиталовложения в разработку того или иного продукта приходится делать без достаточных гарантий того, что этот продукт из нового сырьевого источника будет разрешен к использованию.

Принципы построения безопасных технологических процессов -в обобщенном виде представлены ниже. Ответственность за безопасность должна лежать в одинаковой степени на главе управления данного предприятия и на не зависящем от него работнике внешней инспекции.

Инженерные мероприятия

1. Ограждение предприятия.

2. Полная изоляция рабочего оборудования от внешней среды.

3. Контроль воздуха общего предназначения и отдельно воздуха, отходящего от рабочих установок и из рабочих помещений.

4. Строгий контроль входа персонала на предприятие и выхода из него.

5. Применение защитной одежды.

6. Санобработка и деконтаминация персонала.

7. Организация специальных зон приема пищи.

Контроль окружающей среды

1. Регулярная очистка предприятия.

2. Построение процессов со сведением к минимуму риска.

3. Первичное и периодические определения фона воздуха.

4. Первичное и периодические измерения величины воздушных потоков.

5. Контроль оборудования в ходе операций.

Наблюдения за персоналом

1. Первичные и периодические диспансерные осмотры.

2. Постоянная регистрация отсутствующих и больных.

3. Установление системы информации о несчастных случаях и о заболеваниях.

4. Постоянная связь и взаимодействие с медицинскими работниками.

8. Резюме по процессам выделения

8.1 Выделение внеклеточных ферментов

Число последовательных технологических стадий для выделения внеклеточных ферментов обычно меньше, чем для внутриклеточных. Однако существует широкий диапазон возможных операций и уровней фракционирования. В табл. 1 в обобщенном виде представлены некоторые альтернативные технологические стадии, а также приведены количественные данные о степени концентрирования продуктов на отдельных стадиях и в целом по процессу. Интерес представляет в первую очередь степень концентрирования фермента из культуральной жидкости, а не его чистота. Относительное совершенство каждого процесса и метода, а именно различных методов осаждения, процессов сепарации в системе твердое тело - жидкость, концентрирования и высушивания оценивается именно по показателю системы концентрирования.

Underkofler описал технологию выделения а-амилазы из В. subtilis с выходом 63 % следующим образом:

Исходная культура. В. subtilis на питательном агаре; инкубация при 32 °С; хранение при 0--5°; пересев каждые 2 мес.

Посевные колбы. Колбы вместимостью 2,2 л, содержащие 1 л среды; инкубация 12 ч при 32 °С па качалке с возвратно-поступательным движением.

Посевная емкость. 180 л среды; 10 ч при 32 °С; давление в емкости 0,2 кгс/см2; подача воздуха 150 л/мин; частота вращения мешалки 150 об/мин.

Ферментация. Комплексная среда в составе: мука соевых бобов 1,85% с содержанием растворимых сухих веществ 0,76%; ферментативный гидролизат казеина 0,65%; лактоза 4,75%; MgS04-7H20 0,04%; противопенный агент 0,05%. Количество среды 5000 л; температура 35°С; давление в ферментаторе 0,3 кгс/см ; частота вращения мешалки 170 об/мин; подача воздуха 3000 л/мин.

Выделение растворенного нативного фермента. 5500 л культуральной жидкости (2160 BAU/мл); 2% диатомита к объему культуральной жидкости, вакуумная предфильтрация с подвижным ножом; объем фильтрата с промывной водой 5000 л (2000 BAU/мл).

Осаждение. 13600* л денатурированного спирта добавлено при перемешивании; после выстаивания декантация надосадочной жидкости; добавлено 4500 л спирта; надосадочная жидкость вновь декантирована.

Сепарация в системе твердое вещество -- жидкость. С помощью пластинчатого и рамного прессов. Высушивание. Вакуумная сушка в течение 8 ч.

Отделочные операции и составление композиции. Продукт-- 73,5 кг (102000 BAU/r) смешан с 385 кг гипса (16800±5 BAU/r).

Данные более поздних разработок в нашем распоряжении отсутствуют. Однако не вызывает сомнения, что новейшие методы флокуляции, ультрафильтрации и высушивания оказали свое влияние на построение соответствующих процессов. Типовая схема производства внеклеточных ферментов показана на рис. 3.

8.2 Выделение внутриклеточных ферментов

Во введении в данную главу отмечалось, что выделение внутриклеточных ферментов требует фракционирования весьма сложной смеси продуктов по сравнению с простой обработкой внеклеточной культуральной жидкости при получении соответствующих ферментов. Это фракционирование за последние 50 лет закреплено во многих конкретных методах обработки. Среди работников лабораторий укоренилась тенденция рассматривать каждый метод выделения ферментов как уникальный. Несомненно справедливо, что каждый фермент отличается специфичностью, но мнение о том, что для каждого фермента метод выделения должен быть обязательно свой, ведет к замедлению создания технологии и отдельных ее операций. А фактически анализ любого набора практических рецептов для выделения ферментов показывает, что широко применяется в реальных условиях лишь относительно небольшое число процедур. Безусловно, промышленное выделение внутриклеточных ферментов требует большей гибкости при применении различных методов, чем выделение внеклеточных ферментов. Тем не менее, и для выделения внутриклеточных ферментов может быть разработана относительно стабильная технология и оборудованы производственные линии. Выделение аспарогеназы на промышленном уровне подтверждает дальнейшие возможности совершенствования этого процесса.

Ферментация. Вместимость встряхиваемых на качалке колб 250 мл, ферментаторов от 400 л до 75,7 м3 (выход снижается до 70%). Среда -- настой пшеницы; критический питательный компонент--аминокислоты; мощность подводимой энергии 0,3--0,4 л. с./378,5 л.

Выделение клеток. Дисковая центрифуга с соплами (1300 g), производительность 26.5 л/мин. Концентрирование от 6 г/л до 120 г/л (по массе СВ).

Разрушение клеток. Гомогенизатор APV фирмы «Manton Gaulin»,-- 2- кратное пропускание (563 кг на см2); при первом пропускании высвобождается 90% фермента, при втором --97%; подъем температуры до 30 °С; охлаждение рассолом.

Отделение остатков клеток и белка. Добавление 3 3% этанола (пол слои жидкости); удаление твердой фазы под давлением на ротационном фильтре (11,25 м2); за время менее 2 ч получается 7570 л фильтрата. Осаждение фермента. 50 % метанола; пониженные значения рН.

Фильтрация. Фильтр-пресс (1,62 м); добавление кизельгура; ресуспендирование фермента в 946,25 л воды. Переосаждение фермента. 60% метанол.

Отделение твердой фазы: С помощью центрифуги Шарплес с трубчатой корзиной.

Концентрирование. Путем ультрафильтрации (выход 90 %).

Хроматография. Сефадекс DEAE-A50 (колонка: диаметр 29,48 см. высота 58.96 см); исходный буфер 0.025М до 0.12М; осаждение фермента; ресуспендирование; хроматография с помощью СМ-целлюлозы (0,11 г белка/г полимера); снижение содержания пирогенных веществ.

Кристаллизация. С помощью 0,6 объема этанола; рН 5. Сбор осадка с помощью центрифуги с твердой корзиной.

Стерилизация. Обработка углем, стерилизующая фильтрация; обработка маннитолом; сушка сублимацией.

Выход. 1 кг кристаллической аспарагиназы (30%--общий выход); длительность всего цикла --24 ч; многочисленные стадии обработки перед ультрафильтрацией; стерилизация, которая не полностью касается аспарагиназы; ламинарное движение воздуха; вода, свободная от пирогенных веществ.

8.3 Непрерывное выделение ферментов

При рассмотрении отдельных операций было показано, что осуществление, например, таких стадий, как осаждение, сепарация в системе твердая фаза -- жидкость, классическими периодическими методами оказывается слишком сложным. Масштабирование периодических процессов при неизбежном увеличении продолжительности процесса часто сопровождается значительной потерей активности фермента. Непрерывные операции имеют еще то дополнительное преимущество, что они позволяют использовать оборудование в незначительных масштабах и в этом отношении в положительную сторону отличаются от периодических процессов, которые, как правило, имеют дело с крупногабаритным оборудованием. Непрерывное выделение ферментов осложняется требованием надежности применяемого оборудования и выбора его с таким расчетом, чтобы производительности на отдельных стадиях процессов были равны. Решение этих проблем может быть значительно упрощено благодаря внедрению небольших промежуточных емкостей, играющих роль буферных, и перевода полностью непрерывного режима в полунепрерывный.

8.4 Одновременное выделение внеклеточных и внутриклеточных ферментов

Подавляющее большинство схем выделения ферментов предусматривают регенерацию отдельных ферментов. В случае внеклеточных ферментов это может быть подтверждено на многих примерах, поскольку практически лишь один внеклеточный фермент в смеси различных продуктов имеет значительную концентрацию. Для дополнительного получения внутриклеточных ферментов или иных внутриклеточных продуктов требуется разрушить клетки и подвергнуть полученную смесь строгому фракционированию. Однако, если осуществлено выделение хотя бы одного внутриклеточного фермента, к стоимости процесса дополнительно добавляется стоимость разрушения клеток и удаления их остатков и значительно превосходящая ее стоимость осадителей и адсорбентов независимо от того, сколько ферментов и других продуктов фактически выделено из клеток. В этом отношении полезно проведение аналогии с фракционированием нефтяных продуктов.

Известно множество примеров одновременного выделения из субстрата ряда животных ферментов. Особенно хорошо разработан процесс выделения гликолитических ферментов из мышечной ткани. Последняя очень подходит для этой цели, так как различные ферменты содержатся в ней в достаточно высоких концентрациях. Одновременное выделение внутриклеточных микробных ферментов осуществляется пока крайне редко, является менее прямым процессом, изучение которого началось, по сути дела, только в самое последнее время. Есть основания полагать, что аффинная хроматография может существенно облегчить разработку технологии одновременного выделения внутриклеточных и внеклеточных микробных ферментов. Прогрессу указанных исследований и разработок будет также способствовать разработка более экс-прессных систем аналитического контроля, поскольку последний при процессах выделения нескольких ферментов является исключительно сложным, особенно во время разработки этих процессов.

Список использованных источников

1. Д. Уонг, Ч. Кооней. Ферментация и технология ферментов. М: Легкая и пищевая промышленность, 1983г.

2. Ред. коллегия М Ф. Гулый. Ферменты в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Киев, «Наукова думка», 1968г.

3. Ред. акад. А.А. Имшенецкий. Ферменты микроорганизмов. М.: «Наука», 1973г.

4. Ред. Я.М. Варшавского. Ферменты и синтез биополимеров. М.: «Мир», 1967г.

5. Н.П. Блинов. Основы биотехнологии. Для студентов институтов; аспирантов и практических работников. Издательская фирма «Наука». СПб| 1995г.

6. В.К. Акименко. Альтернативные оксидазы микроорганизмов. М., Наука, 1989г.

7. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2 частях. М., Мир, 1989г.

8. A.M. Егоров., А.П. Осипов., Б.Б. Дзаптиев., Е.М. Гаврилова. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.. Высшая школа, 1991г.

9. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда. М., Мир, 1988г

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6