5.1 Электрофорез
Термином «электрофорез» описывается процесс разделения ферментов на основе дифференциальной их миграции в электрическом поле. При проведении лабораторных работ в области аналитической биохимии электрофорез представляет собой метод, обеспечивающий высшую степень разделения ферментов на принципах физико-химической сепарации. Поэтому указанный метод изучался прежде всего с точки зрения препаративной сепарации. Именно для такого предназначения создано несколько специальных приборов. Однако необходимо иметь в виду, что на электрофоретическую подвижность ферментов решающим образом влияет ряд факторов; они могут быть ответственными за разочаровывающие результаты. Во-первых, электрофоретическая подвижность макромолекул низка, вследствие чего соответствующая операция разделения характеризуется малой скоростью и диффузия будет приводить к размыванию концентрационных зон, а ферменты -- смешиваться с медленно движущимися продуктами электролиза. Подвижность молекул варьирует в обратном отношении к вязкости среды. Если отвод тепла от различных участков поперечного сечения сепарационной камеры происходит с разной интенсивностью, то подвижность молекул по поперечному сечению будет варьировать. Это обусловлено вариациями температуры по поперечному сечению и зависимостью вязкости от температуры. Наличие твердой фазы, хотя она сама по себе и не важна как объект для выделения, контролирует конвекционные возмущения потоков в сепарационной камере и вызывает гравитационные разрушения уплотненных зон. Твердая фаза также уменьшает подвижность молекул. Эти и другие проблемы осложняют применение методов перепаративного электрофореза. Капитальные затраты, относящиеся особенно к оформлению процессов охлаждения сепарационной камеры, удалению из нее продуктов электролиза и обеспечению безопасности эксплуатации, довольно высоки. Электрофорез может играть определенную роль только в процессах крупномасштабного выделения некоторых ферментов, особенно при сепарации ферментационных мультисубъединиц, которые подвержены разрушению в присутствии твердой фазы и требуются при хроматографии.
5.2 Зональное ультрацентрифугирование
Центрифугирование при очень высоких частотах вращения было рассмотрено ранее применительно к сепарации твердой и жидкой фаз.
Однако первоначально намечалось как метод высокоразделяющей сепарации частиц, находящихся в растворе. При использовании для целей дифференциальной миграции ротор ультрацентрифуги заполнялся жидкостью определенной плотности, и к оси ротора таким образом добавлялась некоторая кольцевая зона. Эта зона подвергалась воздействию центробежных сил, что заставляло частицы различной плотности мигрировать из нее наружу с различными скоростями. Метод приобрел большое значение при очистке вирусов, которые по своей величине, в общем, на один порядок крупнее молекул ферментов. Гравитационные поля, требующиеся для разделения молекул ферментов, слишком велики. Поэтому в настоящее время очевидно, что использование метода будет и впредь ограничиваться экстремально крупными ферментативными комплексами. Кроме того, даже при использовании наиболее подходящих по величине роторов эффективная вместимость, центрифуг незначительна. Как и в случае электрофореза, метод зонального ультрацентрифугирования имеет то преимущество, что он не связан с наличием в жидкости твердой фазы. Однако присутствующие в растворе химические вещества, создающие градиент плотности, могут повреждать структуру комплексов ферментов.
6. Отделочные операции
Общепринято к отделочным операциям относить такие, как стерилизация продукта, уменьшение его размеров в товарном виде, таблетирование и составление рецептур, а также обессиливание ферментов, их концентрирование, высушивание, хранение на складе и контроль чистоты. Хотя эти установленные конечные, или отделочные операции предшествуют непосредственному выпуску препаратов в продажу, они могут в ряде случаев иметь даже более важное значение, чем собственно операции очистки ферментов. Во всяком случае, для внеклеточных ферментов дело обстоит именно так. Для ряда практических применений внутриклеточных ферментов фракционирование требуется лишь для того, чтобы избавиться от некоторых контаминантов. Остальные требования определяются исключительно стремлением придать выпускаемому продукту надлежащую форму и внешний вид и необходимостью точной и воспроизводимой их специфичности. Большинство отделочных операций -- это скорее обобщение результатов практических традиционных приемов работ внутри той пли иной компании, чем воплощенный в натуре итог исследований. Исследовательские учреждения обычно не интересует такое свойство продукта, как сохраняемость; их критерий чистоты часто отличается от критерия, каким руководствуется изготовитель.
6.1 Обессоливание
Многие ферментные препараты нуждаются в освобождении от неорганических солей, которые придают продуктам неприятный запах и нежелательны в клиническом отношении. Обессоливание ферментных препаратов может также играть важную роль как промежуточная стадия в технологическом процессе выделения химически чистых ферментов. В частности, эта стадия предшествует очистке ферментов с помощью ионообменной абсорбции. Термин «обессоливание» также широко применяется для описания процессов удаления любых низкомолекулярных соединений из ферментных препаратов с помощью операций, которые не учитывают различий между ионами и незаряженными низкомолекулярными соединениями.
Классический метод удаления из препаратов мелких ионов с использованием смешанной ионообменной насадки был применен к очистке некоторых наиболее устойчивых ферментов. Это применение основывается на наличии у гидрофобных углеводородно-основных ионообменников пор весьма малого размера. Такие ионообменники имеют очень низкую емкость по макромолекулам, но высокую емкость по ионам. Посредством применения смешанной насадки из катионных и анионных ионообменных смол становится возможным удалить из обрабатываемых препаратов как положительно, так и отрицательно заряженные ионы. К сожалению, гидрофобная природа указанных ионообменников и формирование на их поверхностях мощных зарядов приводят к возможности денатурации обрабатываемых ферментов. Данный метод имеет значительную конкуренцию со стороны второго хроматографического метода -- метода гельфильтрации, который был описан выше. Возможности этого метода для осуществления, в промышленных масштабах операций удаления из ферментных препаратов различных ионов или мелких молекул доказаны вполне надежно. При этом неизбежно разбавление препаратов. В процесс вовлекаются только две фракции, а поскольку гельфильтрация не предполагает использования специфических сорбционных участков насадки, она может проводиться при высокой загрузке колонки, что ограничивает степень разбавления. Серьезно осложняет разделение ферментных препаратов высокая вязкость соответствующих растворов; не меньшую проблему составляет засорение геля белковыми материалами. Однако применение Сефадекса, который представляет собой декстран G-25 с поперечными связями, снимает последнюю проблему, так как он выдерживает очистку с помощью раствора гидроокиси натрия.
При удалении из ферментных препаратов всех низкомолекулярных соединений важную роль играют два мембранных метода -- диализ и ультрафильтрация. Обычно ультрафильтрация будет позволять удалять низкомолекулярные соединения по существу с той же скоростью, как и воду. Обеспечив подпитку воды в ультрафильтрационную камеру, можно добиться достаточно эффективного удаления из системы и других молекул, помимо молекул воды. «Диафильтрация» обычно осуществляется при разбавлении на первой стадии препарата до необходимого уровня с тем, чтобы снизить до минимума концентрационную поляризацию.
Теоретически ультрафильтрация превосходит по своим возможностям диализ, так как ее реализация не требует преодоления предельной концентрации соли на фильтрующей стороне мембраны. Однако концентрация соли при диализе может поддерживаться на низком уровне благодаря быстрому пропусканию воды через фильтрующую сторону мембраны. Для этой цели может оказаться полезным применение деионизированной воды, позволяющее предотвратить контаминацию мембраны металлическими солями при промывке ее противотоком.
Серьезные ограничения, которые могли бы налагаться на процессы ультрафильтрации концентрационной поляризацией, в случае очистки диализом не выявлены, хотя это явление не теряет своей значимости с точки зрения достижения эффективного перемешивания потока продукта.
Фирмы, выпускающие оболочки для колбасных изделий," в качестве вторичных продуктов производят также трубки для диализа. При этом в процессе производства соответствующих мембран в них неизбежно остается определенное количество металлических ионов и соединений, содержащих серу. Металлические ионы могут вызывать денатурацию обрабатываемых ферментов. Поэтому мембраны перед их применением подвергаются обычно кипячению в несколько раз сменяемых порциях воды, куда может добавляться этилендиаминтетрауксусная кислота.
В результате исследований процесса ультрафильтрации разработано новое поколение микротрубчатых диализирующих мембран. Мембраны образуются из большого количества микротрубок, заделываемых вместе в так называемый модуль с общим входом и общим выходом. Соотношение площади поверхности модуля и его объема является очень высоким. Конструкция оказалась весьма эффективной, если не считать подверженности ее забиванию нерастворимыми твердыми веществами. Кроме того, изготовление модулей обходится довольно дешево. Есть основания надеяться, что высокая эффективность диализирующих мембран подобного рода и их модульная форма вновь пробудят интерес к практическому применению процессов диализа.
Подобно ультрафильтрации, диализ может привести к значительной утрате активности фермента, однако маловероятно, что эта утрата обязана наличию срезающих усилий. Скорее всего инактивация фермента при диализе происходит из-за наличия в мембранах каких-то контаминантов или межфазных границ, локально ограничивающих поток материала.
6.2 Концентрирование
Концентрирование -- одна из основных стадий технологического процесса выделения внеклеточных ферментов. Как отделочная операция концентрирование обычно осуществляется методами сушки. При выделении внутриклеточных ферментов часто оказывается необходимым сконцентрировать жидкость во время промежуточной стадии очистки, поскольку высокая разделяющая способность соответствующих методов может приводить к избыточному разведению продукта. При низких уровнях содержания белка последний имеет выраженную тенденцию к покрытию рабочей поверхности плотным слоем. Твердые фазы, применяемые в хроматографии, обладают особенно большой площадью поверхности.
При концентрировании ферментов может применяться оборудование, обеспечивающее испарение влаги из материала при пониженных температурах, как это уже сделано применительно к технологии производства фруктовых соков могут быть использованы методы полного осаждения или полной адсорбции. Для изоляции внутриклеточных ферментов разумное применение соответствующей стадии обработки в определенные моменты процесса многостадийной очистки может в ряде случаев позволить исключить необходимость проведения собственно стадии концентрирования, которая по своей сути должна рассматриваться как непроизводительная. Такое построение процесса особенно важно в промышленных условиях, где концентрирование обходится довольно дорого, протекает медленно и может часто приводить к денатурации больших количеств продукта.
6.3 Сушка
Для сушки ферментов могут с успехом применяться промышленные методы, разработанные применительно к получению "пищевых и фармацевтических продуктов. Как и в случае других биологических материалов, наиболее устойчивые ферменты могут быть высушены в распылительных сушилках или тепловым способом под вакуумом; менее стойкие требуют сушки в за мороженном состоянии (сублимационная сушка).
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
