содержит 472 источника, в том числе 61 отечественных и 411 иностранных
авторов.
Собственные исследования.
1. Материалы и методы исследований.
Работа выполнена во ВНИИЭВ им. Я. Р. Коваленко и МГУПБ в период
1974—1995г.г. Выполненные исследования являлись частью плановой научной
тематики ВНИИЭВ и МГУПБ. Отдельные этапы исследований проведены совместно с
Сидоровым М.А., Шубиным В.А., Гумбатовым Ю.К., Мицаевым Ш.Ш., Блему Ж.,
Силла Ф., Лаврентьевым Н.И., Романовой Л.Я., Субботиным В.В.,
Пруссак—Глотовым В.Э., Логиновым И.А., Корнелаевой Р.П.
Ряд комплексных исследований проведен совместно с сотрудниками
лаборатории патологической анатомии ВНИИЭВ проф. Шубиным В.А., Татришвили
И.К., Андрышиным А.Н., лаборатории молекулярной биологии и биохимии ВНИИЭВ
Артюхиным С.К. и Фоминым Б.А.
В работе использовали 30 штаммов типовых культур бактерий семейства
Pasteurellaceae: Actinobacillus ( Haemophilus ) pleuropneumoniae
( серовары 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12, ) , Pasteurella – haemolytica –
подобные бактерии, гемофильные бактерии «малой группы», таксона «С»,
H.influenzae, H.parainfluenzae, H.parasuis ( серовары А,В,С,Д ),
P.multocida ( серовары А.В.Д ). Также использовали культуры S.aureus
(шт.№СТС 8530, 209 р.), S.epidermidis (шт.АТСС14990),S.saprophyticus
(шт.2284 ИГ),
В.megatherium (шт. №654), B.subtilis, S.cholerasuis (шт.№370),
S.typhimurium (шт.№415).
Подробному изучению включая нумерический анализ, подвергнут 141 штамм
НАД--зависимых эпизоотических культур бактерий, выделенных нами от свиней,
и 160 штаммов подвергнуты серологической идентификации. Бактериологически
или патологоанатомически исследованы материалы от более 2200 свиней.
При изучении вопросов пато- и иммуногенеза использовали 157 свиней, 210
морских свинок, 546 белых мышей.
Для культивирования НАД--зависимых бактерий применяли «шоколадный»
агар, бульон и агар Левинталя, сывороточно-
-дрожжевой агар и бульон, кровяной агар и бульон на основе МПБ, МПА,
бульона и агара Хоттингера. В качестве источников специфических ростовых
факторов использовали кристаллический гемин («Реахим»), НАД («Реахим»),
дрожжевой экстракт, кровь различных видов животных, питающие культуры
бактерий («баккормилки»). Культивирование бактерий в жидких питательных
средах осуществляли в стационарных условиях и в режиме аэрирования
(лабораторный ферментер). Морфологические, тинкториальные, культуральные и
ферментативные свойства бактерий
исследовали общепринятыми методами. В дифференциально—диагностические среды
при определении ферментативной активности добавляли НАД и гемин, а также
использовали СИБ и ПВДЭ—диагностические наборы производства Горьковского
ИЭМ. Особенности колоний изучали в косопадающем пучке света при помощи
стереоскопического микроскопа МБС—1, (Акатова Н.С.,1966).
При проведении нумерического анализа у каждого исследованного штамма
бактерий определяли 57 физиологических признаков, показатели
преобразовывали в числовую форму, затем при помощи ЭВМ вычисляли
коэффициент несоответствия по формуле
[pic] где:
a - количество несовпадающих признаков,
b - количество совпадающих положительных признаков,
c - количество совпадающих отрицательных признаков.
Полученную матрицу коэффициентов подвергали кластерному анализу с
представлением конечных данных в виде дендрограммы, отображающей
распределение штаммов по кластерам ( фенонам ).
Для генетической характеристики ( исследования проведены совместно с
Артюхиным С.К. и Фоминым В.А. ) эпизоотических и референтных штаммов ДНК
выделяли по методу Marmur (1961 ). Нуклеотидный состав определяли
спектрофотометрически по тепловой денатурации с помощью спектрофотометра
«Спекорд М-40».
Меченые [pic] препараты ДНК получали с помощью реакции НИК -
трансляции ( Маниатис и соавт.,1985 ). Реакцию ДНК – ДНК гибридизации
проводили по методу Денхардта ( 1966 ). Степень подобия нуклеоидных
последовательностей ДНК определяли, принимая за 100% радиоактивность
гомологической реакции.
При изучении антигенной структуры бактерий использовали кроличьи
гипериммунные сыворотки на цельные микробные клетки. Пробирочную и
пластинчатую РА ставили по Mittal K. и соавт. ( 1984 ),
при постановке РА с 2 - меркаптоэтанолом ( 2МЭ ) серийные разведения
сыворотки делали в растворе с 0,1М -2МЭ. Эритроцитарные антигенные
диагностикумы для РНГА готовили по методу Сидорова М.А. и Агаевой Э.М.
Ставили РНГА и учитывали результаты общепринятым способом. Антительные
диагностикумы для реакции коагглютинации готовили по Mittal K. и соавт. (
1987 ). Реакцию иммунофлуоресценции в двух ступенчатом варианте проводили с
использованием коммерческих меченых ФИТЦ, антикроличьих сывороток и
люминесцентного микроскопа МЛ - 2.
Реакцию ставили в классическом варианте, при исследовании свиных
сывороток крови – по Nicolet J. (1971 ) с добавлением в комплемент
сыворотки крови крупного рогатого скота.
При оценке вирулентности бактериальных культур определяли
[pic]по Риду и Менну. Остаточную токсичность инактивированных вакцин
определяли, используя тест прироста живой массы мышей. При определении
специфической активности экспериментальных вакцин рассчитывали [pic],
индекс и коэффициент эффективности препарата ( Безденежных И.С., Леонтьева
Л.Г.,1969 ).
Цифровой материал обрабатывали, используя общепринятые методы
математической статистики ( Ашмарин И.П., Воробьёв А.А., 1962; Терентьев
П.В., Ростова Н.С.,1977 ).
2. Результаты исследований.
2.1. Свойства возбудителей, таксономическое положение и разработка
лабораторной диагностики актинобациллёзной (гемофилёзной) плевропневмонии
и гемофилёзного полисерозита свиней .
2.1.1. Питательные среды и культивирование A.pleuropneumoniae и
H.parasuis.
Конструирование питательных сред для культивирования
A.pleuropneumoniae и H.parasuis предполагает учёт потребности данных видов
в НАД. Минимальный уровень зоны оптимума у обоих видов бактерий близок и
составляет 1,8 - 3,6 НАД в 1[pic] среды. Верхний пороговый уровень имеет
видовые и штаммовые различия, причём он ниже у H.parasuis (15,62 – 31,25
мкг/[pic]), чем у A.pleuropneumoniae (250мкг/[pic]) и, в свою очередь, он
меньше в пределах вида H.parasuis у свежевыделенных эпизоотических штаммов,
нежели у адаптированных музейных культур. Полученные данные позволили
обоснованно конструировать питательные среды свиноводства учётом возможных
штаммовых потребностей в НАД. Из естественных источников НАД наиболее
доступен и эффективен дрожжевой экстракт. Переживающие животные ткани также
содержат достаточное для роста V - зависимых бактерий количество НАД.
Наиболее удобно в этом случае использовать кровяной сгусток на агаре
Цинссера или сывороточном агаре.
Испытание различных видов питающих культур бактерий как продуцентов
НАД показало, сто ростовой фактор экскретируют в достаточных количествах
интенсивно растущие виды бактерий (эшерихии, сапрофитные бациллы,
стафилококки), которые обеспечивают зону от 16,8 ± 0,89 мм до 31,6 ± 1,14мм
в зависимости от вида бактерий и типа питательной среды.
Однако, при использовании культур стафилококков, установили, что
некоторые из них ингибируют сателлитный рост A.pleuropneumoniae. Мы не
обнаружили описание подобного феномена, хотя он известен у P.multjcida. Но
в литературе есть сообщения о наличии гиалуроновой кислоты в составе
капсулы некоторых штаммов A.pleuropneumoniae. Следовательно, причиной
ингибиции роста может быть синтез культурой стафилококка гиалуронидазы. Мы
также не исключаем вероятность образования продуцентом НАД соединений типа
НАД-азы. В любом случае, питающая культура бактерий должна быть
предварительно проверена по указанному критерию.
Определение НАД - зависимости – важный этап в идентификации
A.pleuropneumoniae (1-й биовар) и H.parasuis. Наши данные о том, что
референтные и эпизоотические культуры A.pleuropneumoniae периодически могут
утрачивать НАД- зависимость, причём это касается любого штамма 1-го
биовара. Явление НАД -зависимости может быть восстановлено у культур,
утративших это свойство, путём культивирования на «обеднённой» питательной
среде с локальным источником НАД. Следовательно на обычных питательных
средах животного происхождения культуры, потерявшие НАД зависимость,
утилизируют какие-то предшественники НАД, отсутствующие, например, в
глюкозо-казеиновом агаре. На последней питательной среде их рост возможен
только в присутствии НАД, зависимость от которого они приобретают вновь.
Результаты исследований по изучению НАД - зависимости гемофильных
бактерий позволили нам дать оценку и рекомендовать для практических целей
сочетание питательных сред, позволяющих в условиях диагностической
лаборатории тестировать V - и Х - зависимость.
Исследования показали отсутствие СО2 - зависимости у изученных
культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae, а также не удалось обнаружить
существенных различий в частоте изоляции культур из патологического
материала в условиях обычной атмосферы и повышенного содержания СО2 . Оба
вида бактерий показали сильную зависимость от наличия в питательной среде
сыворотки крови. У H.parasuis эта потребность выражена сильнее, чем у
A.pleuropneumoniae. При отсутствии в питательном субстрате сыворотки крови
оба вида бактерий быстро диссоциируют.
Количественные показатели, характеризующие рост A.pleuropneumoniae и
H.parasuis в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера, 120мг % аминного
азота, рН 7,6,5,% сыворотки крови крупного рогатого скота, 10% дрожжевого
экстракта), свидетельствуют о более интенсивном росте первого вида, в
частности, период генерации соответственно составил 40,8 и 67 минут,
удельная скорость роста 1,008 и 0,622, прирост бактериальных клеток за 1
час культивирования 0,44 и 0,27 log.
Оценка питательных сред для первичной изоляции культур H.parasuis и
A.pleuropneumoniae (1-й биовар) показала, что для этой цели могут быть
использованы агар и бульон Левинталя, «шоколадный» агар, сывороточно-
дрожжевой бульон и агар, сывороточный и кровяной агар, с локальными
источниками V - ростового фактора. Предпочтительнее использование
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
